某国产NAT试剂盒应用于血液筛查的评价与应用

陈志忠　李结敏　廖扬勋　梁剑锋　余文潮　谭晓颖　梁丽婷　黄钜明　陆倩文　陈尚良



某国产NAT试剂盒应用于血液筛查的评价与应用

陈志忠李结敏廖扬勋梁剑锋余文潮谭晓颖梁丽婷黄钜明陆倩文陈尚良★

［摘要］目的评估、验证某国产血液NAT试剂盒用于血液筛查的技术性能指标。方法对某国产血液NAT试剂盒进行了灵敏度、特异性、重复性、抗干扰能力和抗污染能力测试，并将其初步用于血液筛查。结果乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）RNA、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）RNA三者检测灵敏度分别为不高于50 IU/mL、50 IU/mL与100 IU/mL；特异性、重复性、抗污染能力能满足血站血液核酸检测需求；混检模式下，HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者的检出基本不受脂肪血颗粒的影响，但在单检模式下会导致HIV RNA的漏检，溶血对HBV DNA HCV RNA、HIV RNA的检出均有明显干扰。结论某国产NAT检测分析系统的灵敏度、特异性、重复性、抗污染能力等指标均达《血站核酸检测质量控制指南》要求，脂肪血、溶血样本能明显干扰HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA的检出能力。

［关键词］血液筛查；核酸检测；HBV DNA；HCV RNA；HIV RNA

★通讯作者：陈尚良，E-mail：fimmu2000@163.com

为避免经输血传播疾病，各国采供血机构都对献血者进行了严格的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）病毒抗原或抗体检测。但血清学检测技术存在“窗口期”、病毒变异、免疫沉默等造成的漏检，血液的病毒安全性问题是全球关注的焦点问题［1］。为保障输血安全，世界各国不断开发和引进新的血液筛查技术［2-5］。为了进一步保障血液安全，我们国家提出了“十二五”期末实现血液核酸检测全覆盖的目标。然而，进口核酸检测（nucleic acid test，NAT）试剂成本较高，综合考虑国家政策导向和自身实际情况，我们对国产产品—达安基因血液NAT试剂盒进行了评估，并应用于血液核酸检测，现把研究报告如下。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器

ChemagicSTAR核酸提取仪（HAMILTON，瑞士），ABI7500实时荧光定量PCR仪（Life Technologies，美国），核酸分离试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司），核酸检测试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司），外部质控品（中山大学达安基因股份有限公司）。

1.2灵敏度试验

按照厂家说明书要求，将外部质控品分别稀释至2倍检测极限（limit of detection，LOD）、1倍LOD、0.5倍LOD，即浓度分别200 IU/mL、100 IU/ mL、50 IU/mL，单采用检模式进行3次检测。检测标准：1倍LOD处浓度应100%检出。

1.3特异性试验

将8份阴性质控品混合至一个pool检测；将8份阳性质控品混合至一个pool检测，然后再进行拆分检测。检测标准：阴性、阳性样品应该全部检出。

1.4重复性试验

将阳性质控品每次随机进行混样检测，共检测8次；将阴性质控品采用单检模式进行8管检测。检测标准：阴性、阳性样品应该全部检出。

1.5抗污染能力试验

将8份阴性血浆样本和8份阳性质控品，按照一阴一阳交叉排列，进行检测（单检模式）。检测标准：阴性、阳性样品应该全部检出。

1.6抗干扰能力试验

将阳性质控品（200 μL），添加至脂肪血或者溶血样本（已确认为阴性），制备为含相应干扰物的阳性样本，再进行检测（单检模式）。检测标准：阴性、阳性样品应该全部检出。

1.7血液样本NAT检测

全血样本进行4项目［乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、HCV抗体（Anti-HCV）、HIV抗体（Anti-HIV）、梅毒抗体］2遍酶联免疫吸附检测（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），全项阴性的样本进行NAT混样检测，呈反应性的检测pool再进行拆分确认试验，检测流程参见图1。

2　结果

2.1灵敏度试验

按照厂家说明书要求，将外部质控品分别稀释至2倍LOD、1倍LOD、0.5倍LOD，即浓度分别200 IU/mL、100 IU/mL、50 IU/mL，进行3次检测（单检模式），HBV DNA与HCV RNA在0.5倍LOD处均全部检出，HIV RNA在1倍LOD处全部检出，即HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者检测灵敏度分别为50 IU/mL、50 IU/mL与100 IU/ mL，符合试剂说明书所描述的性能，满足检测要求，结果见表1。

2.2特异性试验

将8份阴性质控品混合至一个pool检测，结果显示为阴性；将8份阳性质控品混合至一个pool检测，结果显示为阳性，然后再进行拆分检测，8管全部为阳性。

2.3重复性试验

将阳性质控品每次随机进行混样检测，共检测8次，均为阳性；将阴性质控品采用单检模式进行8管检测，结果均为阴性。

表1　NAT检测分析系统灵敏度试验评价Table 1　The evaluation of sensitivity for NAT Kit

2.4抗污染能力试验

将8份阴性血浆样本和8份阳性质控品按照一阴一阳交叉排列，进行检测（单检模式），阴性和阳性样本全部通过，交叉污染率为0。

2.5抗干扰能力试验

将阳性质控品（200 μL），添加至脂肪血或者溶血样本（已确认为阴性），制备为含相应干扰物的阳性样本，再进行检测（单检模式）。结果显示脂肪血对混检模式下HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者的检出均无影响，但在单检模式下会导致HIV RNA的漏检；溶血对HBV DNA HCV RNA、HIV RNA的检出均有明显干扰，结果见表2。

表2　干扰能力试验Table 2　Interference ability test

2.6检测拆分率与拆分阳性率评估

试运行至今，共检测样本462份，20批次检测，其中pool阳性2份，拆分阳性2份，均为HBV DNA阳性，拆分率和拆分阳性率分别为10%和100%，经过全项血液筛查（ELISA法）后，HBV DNA检出率为2/462（约4‰），结果见表3。

表3　血液NAT检测试运行结果Table 3　Results of Blood NAT screen at first stage

3　讨论

血液及血液制剂的病毒安全性一直是输血安全的热点问题［1，6］。至上世纪90年代，对输血传播疾病的筛查完全依赖于血清学试验，甚至今天，血清学筛查技术依然是血液筛查的重要手段。1998年德国红十字献血服务中心，将自己创建的NAT方法应用于血液筛查，开启了血液NAT新纪元。分子技术应用于血液筛查，可将HBV、HCV和HIV感染的平均窗口期分别由56天、70天、22天缩短为41天、12天和11天，使输血传播相关病毒的风险降到最低，更大程度地保障血液安全［7］。国外对血液NAT检测的研究较早，积累了较多经验，技术也较成熟，但由于试剂成本较高等原因，一直难以在国内全面推广应用［8-11］。为了贯彻实施国家卫计委关于“十二五”实现血液核酸检测全覆盖的目标以及响应国家关于大型医疗装备优先采购国产产品的号召，我们对某国产品牌的血液NAT试剂盒进行技术评价，并将其初步用于我站的血液筛查。

该国产品牌血液NAT试剂盒，采用混合8人份样本进行核酸提取，然后分别进行HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA 3项扩增，最后通过实时读取数据判断是否具有反应性；反应性的pools再进行拆分确认试验。为了验证试剂盒的检出灵敏度，我们采用外部质控品对试剂盒进行灵敏度进行评价，结果显示HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA检测灵敏度分别为不高于50 IU/mL、50 IU/mL与100 IU/mL，均能达到国家相关要求。然而，与国际知名品牌相比，国产的试剂盒的灵敏度尚存在改进空间。例如Roche的MPX检测系统、Novarits的Tigris Ultrio Plus系统其HIV最低检测限能达到不高于50 IU/mL，HBV、HCV的最低检出限更是达到了不高于10 IU/mL的高灵敏度。

为了评估该国产品牌血液NAT检测系统的抗污染能力，我们模拟日常工作，将强阳性质控品与阴性质控品按照一阴一阳交叉排列，采用单检模式进行核酸提取和扩展检测试验，结果显示本检测系统的抗污染能力满足要求，只要操作规范，阳性样本不会造成交叉污染导致样品间或者实验室污染。同时为了考察检测系统的特异性，我们按前述样本的排序，分别采用混检和单检模式进行核酸提取和扩展检测试验，其实验结果也与预期相符合，显示了较好的特异性。

样本的质量是检测结果的关键保证。在临床检测中，可以通过对患者下医嘱等措施，实施样本采集前的质量控制，而且不合符质量控制要求的样本，可以重新进行样本采集。相比之下，无偿献血行为大多为自发性行为，样本采集难以做到很好的采集前质量控制；同时考虑到血液制剂样本朔源性等问题，对于脂肪血颗粒较多等不符合NAT检测要求的样本，也不可能仿效临床检测进行重新采样。因此，我们对血液筛查样本中最常见的脂肪颗粒、轻度溶血等不合符要求的样本进行抗干扰试验。我们的测试结果显示：混检模式下，HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA三者的检出基本不受脂肪血颗粒的影响，但在单检模式下会导致HIV RNA的漏检；溶血对HBV DNA HCV RNA、HIV RNA的检出均有明显干扰。基于上述结果以及血液检测工作的特点，提示我们在实际工作中，应该尽量避免溶血样本，对于难以避免的脂肪血样本，应该评估脂肪颗粒的严重程度，谨慎对待其核酸检测阴性结果。

通过前述的技术指标评估，我们认为该国产品牌血液NAT试剂盒能满足我们对血液筛查的技术要求，因此试将其用于我站的血液筛查。参考兄弟单位的做法以及厂家的推荐意见，我们初步拟定按照图1的流程进行筛查。试运行期间，共检测样本462份，20批次检测，其中pool阳性2份，拆分阳性2份，拆分率和拆分阳性率分别为10%和 100%。2份阳性样本均为HBV DNA阳性，为了进一步确认献血者感染状况，我们追踪献血者重新采样进行检测，但由于各种原因，仅成功召回1号献血者，采用HBV DNA定量检测系统，能检测到其体内存在低拷贝HBV DNA，同时其e抗原也为阳性，定义为隐匿性HBV感染（occult HBV infection，OBI）感染。以已经确认的数据来计算，经过ELISA过筛后，我们的HBV DNA检出率为1/462；如果以2例阳性来计算，HBV DNA检出率为2/462，与国内报道大体相近［12-16］，但远高于国外的参与风险［17］。当然，我们试运行期间所取得的数据为小样本，更多的检测效能验证有待后续开展，但毫无置疑的是，应用该国产品牌NAT试剂于血液筛查，将进一步提升血液安全特别是HBV病毒性安全。

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·综述·

Evaluation and application of a domestic NAT kit used for blood screening

CHEN Zhizhong，LI Jiemin，LIAO Yangxun，LIANG Jianfeng，YU Wenchao，TANG Xiaoying，LIANG Liting，HUANG Juming，LU Qianwen，CHEN Shangliang★
（Zhaoqing Blood Center，Zhaoqing，Guangdong，China，526020）

［ABSTRACT］ObjectiveTo evaluate the capability of a domestic blood screening NAT kit. MethodsThe sensitivity，specificity，repeatability，anti-interference ability，and anti-pollution ability of the kit were analyzed.ResultsThe sensitivity of HBV DNA，HCV RNA and HIV RNA detection were not more than 50 IU/mL，50 IU/mL and 100 IU/mL respectively，and specificity，repeatability，anti-pollution ability met the demands for blood nucleic acid test.There was no interference due to fat particles in the analyses of HBV DNA，HCV RNA and HIV RNA in mini pool of 8 samples model，but HIV RNA was not detected in ID-NAT model due to fat particles.The detection of those 3 marks was interfered with by hemolysis. ConclusionsThe sensitivity，specificity，repeatability，anti-interference ability and anti-pollution ability of the kit could meet the demands for blood screen，but the interference from fat particles or hemolysis is a concern for the detection capability for HBV DNA，HCV RNA and HIV RNA.

［KEY WORDS］Blood screening；Nucleic acid test；HBV DNA；HCV RNA；HIV RNA

基金项目：广东省医学科学技术研究基金项目（A2015238）；肇庆市科技创新计划（2014E1814）

作者单位：肇庆市中心血站，广东，肇庆526020