Treg细胞和IL-12在肺结核合并老年慢性支气管炎患者外周血中的表达及意义

肖天津　张乐平　古中东　黄延平



Treg细胞和IL-12在肺结核合并老年慢性支气管炎患者外周血中的表达及意义

肖天津1★张乐平2古中东1黄延平1

［摘要］目的研究CD4+CD25+CD127-调节性T细胞（T regulatory cell，Treg）与白细胞介素12 （interleukin-12，IL-12）在肺结核合并老年慢性支气管炎（老慢支）患者外周血中的表达变化及临床意义。方法收集河源市人民医院2012年1月至2015年6月新发肺结核合并老慢支的病人80例（观察组），并以同期单纯老慢支病人80例作为对照组1，健康体检人群80例作为对照组2。分别在治疗前、治疗3月末和6月末，抽取外周血，采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测IL-12水平，流式细胞术检测Treg细胞的表达。采用SPSS 17.0软件，配对t检验比较各组间差异。结果治疗前，观察组患者外周血IL-12水平显著低于两组对照组（P＜0.05）；CD4+T细胞值低于两组对照组（P＜0.05），Treg细胞水平高于两组对照组（P＜0.05），差异均具有统计学意义。治疗3、6个月末，观察组患者外周血调节性T细胞水平明显降低，而IL-12表达水平上升（P＜0.05），差异均具有统计学意义。结论外周血Treg细胞和IL-12表达水平与肺结核具有相关性，可以作为鉴别诊断、病情转归的的辅助指标。

［关键词］肺结核；老年慢性支气管炎；CD4+CD25+CD127-调节性T细胞；白细胞介素12

★通讯作者：肖天津，E-mail：1091870961@qq.com

结核病是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性传染病。由于MTB属胞内寄生菌，T细胞介导的细胞免疫在机体抗结核感染中发挥主要作用。调节性T细胞（T regulatory cell，Treg）是一类具有免疫抑制作用的T淋巴细胞亚群，膜表面高表达CD4和CD25，能识别靶细胞表面主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子所提呈的抗原肽，通过接触依赖或释放细胞因子等多种机制参与机体免疫耐受、免疫自稳等，近来在结核病等慢性感染性疾病中的作用日益受到关注。Treg细胞参与免疫抑制调节使它在结核病中具有双重作用，一方面可以抑制可能对宿主机体组织有害的过度炎症反应，但同时也可能抑制了保护性的免疫反应，反而有利于病原体的持留［1］。巨噬细胞和树突细胞作为抗原提呈细胞吞噬结核分枝杆菌后生成白细胞介素12（interleukin-12，IL-12），IL-12参与Thl细胞从前体的分化，调节Thl/Th2细胞的平衡［2］。而Thl/Th2失衡是结核病的免疫学特征，Th2型细胞应答增强和效应因子分泌增加、炎症介质过度释放又可能与支气管炎症相关。本研究选取肺结核并发老慢支患者，以老慢支患者和健康人群为对照，以了解Treg细胞以及IL-12与老年人慢性支气管炎病人并发肺结核的意义，为辅助鉴别诊断和免疫治疗提供依据。

1　材料与方法

1.1研究对象

选取河源市人民医院2012年1月至2015年6月期间新登记的菌阳肺结核合并老年慢性支气管炎患者80例为观察组，单纯老年慢性支气管炎患者80例为对照组1。并以同期健康体检人群80例作为对照组2。观察组纳入标准：肺结核诊断均按照中华医学会结核病学分会《肺结核诊断和治疗指南》［3］，肺部X线有浸润性病变，痰抗酸染色阳性或阴性，但痰培养抗酸杆菌阳性，经对硝基苯甲酸培养基初步鉴定为结核分枝杆菌排除标准：已经使用过抗结核药物化疗；合并肝炎、糖尿病及其他免疫相关性疾病；使用糖皮质激素及免疫抑制剂。剔除标准：凡治疗6个月后痰菌涂片或培养不阴转者剔除出组。最后纳入80例中男性61例，女性18例，其中年龄60～80岁，平均年龄66.4岁。对照组1均X线检测为慢性支气管炎，结核菌素试验阴性，排除标准同观察组。纳入80例中其中男性65例，女性15例。年龄61～80岁，平均年龄67.9岁。对照组2为健康体检人群，结核菌素试验阴性，排除标准同观察组。男性65例，女性15例。年龄61～80岁，平均年龄67.0岁。所有研究均获得患者知情同意。

1.2主要试剂和仪器

人淋巴细胞分离液购自美国Sigma公司；荧光标记抗体抗人CD3-FITC、CD4-PE、CD25-PerCP、CD127-APC，同型对照小鼠IgGl抗体均购自美国BD公司；IL-12酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒为法国DIACLONE公司产品。FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司产品。二氧化碳培养箱和Multiskan FC酶标仪购自美国Forma Scientific公司。

1.3检测方法

1.3.1标本采集

分别在治疗前、治疗3月末和6月末，采集观察组患者外周静脉血6 mL。其中3 mL肝素抗凝，用于流式细胞术检测外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中Treg细胞的比例。另3 mL于凝血管静置30 min后，1 000 rpm/ min离心15 min，后分离血清，-80℃保存备用。对照组一次性采集外周静脉血6 mL，处理同上。

1.3.2Treg细胞检测

人淋巴细胞分离液分离PBMCs，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）洗涤2次后计数，调整浓度1×107个细胞/mL。每管取1×106个细胞，加入CD3-FITC、CD4-PE、CD25-PerCP、CD127-APC单抗，同时做同型对照管，孵育30 min，PBS洗涤3次后重悬细胞，上流式细胞仪检测。按规程操作，检测结果以CD3+CD4+CD25+CD127-T细胞占外周血单个核细胞的百分率表示。

1.3.3IL-12检测

应用双抗体夹心ELISA法，严格按试剂盒说明进行操作。建立标准曲线，酶标仪上读取吸光度（optical density，OD）值，波长为490 nm，以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，建立标准曲线，根据血清样品的OD值计算IL-12浓度。

1.4统计学处理

2　结果

2.1患者调节性T细胞水平变化

80例肺结核合并老慢支患者患者和对照组外周血CD4+T、CD4+CD25+CD127-Treg细胞水平如下：治疗前外周血PBMCs中的CD4+T细胞低于单纯老慢支患者和健康对照人群，差异有统计学意义（分别为t=119.48，P＜0.05和t=203.20，P＜0.05）。外周血Treg细胞高于对照组，差异有统计学意义（分别为t=164.04，P＜0.05和t=127.43，P＜0.05）。规范治疗3个月、6个月后观察组CD4+（%）水平上升，而Treg细胞/CD4+（%）下降。3月末、6月末CD4+T细胞比例上升，而Treg细胞/CD4+下降，与治疗前有统计学差异（t=13.845，P＜0.05、t=12.282，P＜0.05、t=3.311，P＜0.05、t=17.0765，P＜0.05），具体见表1。

表1　患者外周血CD4+T细胞、Treg细胞及IL-12水平比较Table 1　CD4+T cell，regulatory T cells and IL-12 expression in peripheral blood from different groups

2.2外周血IL-12水平

治疗前老慢支合并肺结核患者患者外周血IL-12水平明显低于单纯老慢支患者（t=68.156，P＜0.05）和健康对照组（t=67.641，P＜0.05），治疗3月末、6月末明显上升，与治疗前有统计学意义（t= 13.721，P＜0.05、t=10.100，P＜0.05）。完成6个月疗程后观察组与健康对照组无统计学差异（P＞0.05）。

3　讨论

T细胞介导的免疫应答在特异性免疫反应中起重要作用。机体抗结核免疫机制主要由Th1、Th2、Treg细胞介导。Th1型免疫反应主要介导机体对于结核病产生保护性免疫，已有研究表明，Th1型细胞免疫反应的过度下调和Th2细胞水平增加与结核病的进展有关［4］。而Treg细胞经细胞表面T细胞受体激活后，可以抑制γδ T-细胞分泌结核特异性IFN-γ，抑制其他CD4+T-cell的反应，使得结核分枝杆菌不能被清除，然而，Treg细胞在在宿主抗感染免疫中所扮演的角色利弊尚不完全清楚［5-7］。He和Pang等［8-9］报道Treg细胞在活动性结核患者表达增高，但也有报道在结核病患者中没有发现这种上升［10］。本研究中结核合并老慢支患者治疗前外周血中Treg细胞均比单纯老慢支及健康对照组高，分析可能是由于Treg细胞具有免疫低反应性和免疫抑制功能的特征，其升高导致免疫抑制作用增强，Th1/Th2免疫应答失衡，可能与结核病慢性发展病程相关。随着抗结核治疗，Treg细胞比例明显下降，Th1/Th2免疫应答恢复，证实Treg细胞参与了疾病的发生发展。Treg细胞的深入研究为结核病的免疫治疗提供了新的思路，Treg及相关免疫抑制性分子可以作为有前途的治疗靶点。

结核分枝杆菌感染导致的宿主免疫应答和病原体免疫逃逸之间的相互作用取决于多种因素，其中细胞因子网络的调节平衡是关键因素之一。结核分枝杆菌早期感染后，DC细胞分泌IL-12，迁移到淋巴结，参与Th1细胞的成熟，诱导IFN-γ的产生［11］，因此IL-12在早期抗结核反应中是启动保护性免疫应答的关键性调控细胞因子［12］。IL-12的高亲合力受体IL-12R在Th1和Th2细胞表面都有表达，IL-12通过与其结合，促进CTL细胞和NK细胞的活化与增殖，并促使两者分泌IFN-γ，抑制IL-4的分泌，调节Th1/Th2细胞的平衡［13］。IL-12的表达水平可以在一定程度上反应机体Th1/Th2偏移情况，但在结核病患者中有关IL-12的表达研究结果报道不一［14-15］，可能与病例纳入与排除的标准不统一、样本数偏少、有些仅为横断面分析等因素有关。本研究对80例新等级菌阳患者的检测结果提示，结核合并老慢支患者外周血治疗前IL-12的水平低于单纯老慢支患者和健康人群，而治疗3月末、6月末逐渐上升，6月末与健康对照组比较无统计学差异。表明IL-12作为Th1型细胞因子，在患者治疗前的低水平可能代表体内细胞免疫功能的低下及机体抗结核保护性免疫力的降低，结核分枝杆菌不能清除或者抑制。有效治疗后，IL-12的上升伴随着Treg细胞水平的下降，表明经抗结核治疗后患者Th1/Th2免疫应答逐渐恢复平衡。因此IL-12水平检测对肺结核合并老慢支的鉴别诊断以及临床病情转归有一定意义。

本文研究了Treg细胞、IL-12在肺结核合并老慢支患者外周血中与单纯老慢支患者、健康人群的表达差异以及治疗过程中的动态变化，这种差异进一步证实了T细胞亚群失衡参与结核病发病。针对Treg细胞在结核病发生的作用，降低患者体内Treg细胞的水平，调节宿主细胞的活化状态机免疫功能，可为结核病的免疫治疗提供新的作用靶点。IL-12可作为判断患者免疫状态及肺结核活动性的临床参考指标，通过检测老年人特别是患有慢性支气管炎病人的细胞因子水平，对老年患者预防结核病有一定意义。

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Expression of regulatory T cells and interleukin-12 in aged patients with active pulmonary tuberculosis complicated with chronic bronchitis

XIAO Tianjin1★，ZHANG Leping2，GU Zhongdong1，HUANG Yanping1
（1.Department of Outpatient，Heyuan People’s Hospital，Heyuan，Guangdong China，517000；2.Department of Outpatient，Shenzhen Center for Chronic Disease Control，Shenzhen，Guangdong，China，518020）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression of CD4+CD25+CD127-regulatory Tregulatory cell（Treg）and interleukin-12（IL-12）in the aged pulmonary tuberculosis complicated with chronic bronchitis. Methods80 cases of aged patients with active pulmonary tuberculosis complicated with chronic bronchitis were included in an observation group from January 2012 to December 2015 in the People’s Hospital of Heyuan city.80 cases with simple old chronic bronchitis and 80 healthy people from physical examination were chosen as the control group 1 and group 2，respectively.The levels of Treg cell（CD4+CD25+CD127-）ratio and peripheral blood IL-12 of the observation group were determined in 0，3 and 6 month intervals and compared with the control groups.ResultsIL-12 level of observation group was significantly lower than the control groups before treatment，the difference was statistically significant（P＜0.05），and CD4+T cells ratio in the peripheral blood is lower than the control groups（P＜0.05），meanwhile the level of Treg cells is higher than the control groups（P＜0.05）.Level of Treg cells decreased significantly and the expression of IL-12 increased after 3，6 month treatment（P＜0.05）.ConclusionExpression of Treg cells and IL-12 is associated with the aged pulmonary tuberculosis complicated with chronic bronchitis，and can be used as a indicators of differential diagnosis and clinical outcome of the disease.

［KEY WORDS］Tuberculosis；Old chronic bronchitis；CD4+CD25+CD127-regulatory T cell；Interleukin-12（IL-12）

作者单位：1.河源市人民医院门诊部，广东，河源517000 2.深圳市慢性病防治中心门诊部，广东，深圳518020