胞外信号调节激酶促进DNA损伤反应的作用机制

魏凤香　张蕾　王绍娟



·讲座·

胞外信号调节激酶促进DNA损伤反应的作用机制

魏凤香1，3张蕾1王绍娟2★

［摘要］机体在长期进化中拥有一整套DNA损伤反应（DNA damage response，DDR）系统来保证基因组的完整性，其中最重要的就是通过激活检验点以阻止细胞周期进程，并修复损伤的DNA。细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路是经典的细胞信号转导通路，具有调节细胞增殖、分化、凋亡等多种功能，二者的功能性联系都能调节细胞增殖。本综述旨在阐述ERK激酶在DNA损伤反应中的作用。

［关键词］DNA损伤反应（DDR）；胞外信号调节激酶（ERK1/2）；细胞周期阻滞；ATM；ATR

★通讯作者：王绍娟，E-mail：lgwsj@hotmail.com

DNA是大而复杂的整体，它在细胞内外各种因素的作用下不断产生损伤。DNA损伤反应（DNA damage response，DDR）可通过识别DNA损伤、激活检验点以阻断细胞周期进程，从而修复损伤的DNA，确保遗传物质准确地传递给子细胞提供时间，这是机体维持基因组稳定性的基础［1］。所有真核生物中，DNA损伤反应集中于一对相关的蛋白激酶：ATM（ataxia-telangiectasia mutated）和ATR（ATM-and Rad3-related）。DNA损伤可激活ATM激酶，后者磷酸化其下游的反应元件使细胞周期阻滞。包括激活检验点激酶2（checkpoint kinases 2，CHK2）和上调蛋白 p21CIP1。p21CIP1是CDK（cyclin-dependent kinases，CDK）的一种抑制剂［2］。CHK2随后使CDC25C失活，CDC25C的活性是激活CDK1和CDK2所必需的［3］。活化ATM 和ATR，激活检验点，阻滞细胞周期进行。

细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen -activated protein kinase，MAPK）通路是经典的细胞信号转导通路，具有调节细胞增殖、分化、凋亡等多种功能。最新的研究发现通常在癌细胞中过表达并促进细胞增殖的ERK激酶，在DNA损伤反应中有重要作用［4］。本文简要阐述ATM/ATR介导的DNA损伤反应，ERK信号通路，以及ERK在DNA损伤反应中的作用。

1　ATM、ATR处于DNA损伤反应的核心

DNA损伤反应是维持真核细胞基因组完整性与保证遗传信息准确传递的重要监督机制。ATM、ATR同属于PIKK家族［1］，是DNA损伤检查点的主要成员，它们被不同类型的DNA损伤所激活。

普遍的观点认为，ATM主要被DNA双链断裂所激活，对双链断裂的ATM反应依赖于3个蛋白的三聚体复合物：Mre11、Rad50和Nbs1（MRN复合物），双链断裂立即在该处快速组装，并帮助将2个末端连接在一起。ATM与MRN复合物中的Nbs1亚单位相互作用，这不仅能将ATM招募到损伤位点处，也能使ATM从无活性的二聚体转变为有激酶活性的单体形式［5-6］。但最近也有研究显示，ATM的激活在没有DNA的情况下，ATP能够使ATM二聚体发生分子间自磷酸化（S1981位点）［7］，导致二聚体的分开，从而引起ATM的激活。最近发现了ATM发生自磷酸化的新位点：Ser367和Ser1893［8］。ATM的这种自磷酸化对其自身的激活可能是必需的。活化的ATM通过磷酸化它的靶蛋白来启动损伤反应。

而ATR能被很多不同形式的DNA损伤所激活，包括核苷酸损伤、复制叉停滞、双链断裂等，这是因为ATR能特定识别单链DNA区域，且在对损伤位点处理过程中单链DNA的产生对于反应是必需的［9］。ATR招募到单链DNA上可能需要通过与包被在单链DNA上的单链结合蛋白RPA相互作用。ATR与单链DNA和RPA复合物的相互作用部分依赖于RPA直接结合到与ATR相结合的接头蛋白亚单位ATRIP。带有ATRIP突变的细胞与ATR突变的细胞有相同的损伤反应缺陷，这表明ATRIP在ATR功能上的核心作用［10］。除了ATR-ATRIP复合物与包被在单链DNA上的RPA的结合是激活ATR所必需的以外，9-1-1复合物也是ATR介导的DNA损伤反应所必需的［11］。9-1-1复合物与DNA的结合依赖于另一个大复合物RAD17-RFC，它为9-1-1复合物装载到损伤DNA上所必需。9-1-1复合物与ATR-ATRIP被独立地招募到DNA损伤位点，随后9-1-1复合物招募TOPBP1，TOPBP1能通过与ATR和ATRIP亚基结合而激活ATR［12］。活性ATR能通过磷酸化一系列下游靶蛋白使细胞周期进程阻滞于S期并起始DNA损伤修复，包括磷酸化位于组蛋白H2AX尾部的SQE序列的S139、p53 S15和CHK1的S345［13］。

2　ERK激酶在DNA损伤反应中的作用

2.1ERK MAP激酶

ERK1/2属于MAPK家族，是Ras/Raf/MEK/ ERK信号通路的重要成分。活化的ERK激酶在多种信号转导通路包括细胞增殖、分化和凋亡的通路中发挥作用。MEK1/2酶通过磷酸化Thr-Glu-Tyr位点的Thr183和Tyr185来激活ERK酶［14］。许多对于细胞的刺激，例如能激活一些转录因子及其它一些与细胞增殖、分化、细胞周期调节和细胞存活有关的丝/苏氨酸激酶的刺激，都能激活ERK1/ERK2。ERK1和ERK2是脯氨酸定向激酶，活化的ERK1/ ERK2将磷酸化底物蛋白中一个脯氨酸引导的基团内的丝氨酸或苏氨酸残基，S/T-P是ERK1/ERK2进行底物识别的最严格的一致序列。许多ERK底物蛋白包含1～2个与ERK结合的位点，通过这些位点与ERK结合后能促进底物蛋白的磷酸化，这些位点包括DEJL（结合ERK、JNK和LXL的部位）和DEF（结合ERK、FXFP的部位）。它们的一致序列是（R/K）2X2-6（I/L）X（I/L）（X指任何残基）［15］。

2.2ERK激酶在DNA损伤反应中发挥作用

DNA损伤反应与细胞分裂紧密联系。ATM或ATR的激活导致蛋白激酶Chk1和Chk2的活化，Chk1和Chk2对Cdc25磷酸酶家族的3个成员有复杂的抑制效应，因而Cdk1-cyclingB1的活性被阻断，阻止了有丝分裂的进入。抑制Cdk的活性或阻滞细胞分裂是ATM或ATR激酶诱导的最终结果。但最新研究表明，细胞分裂也能参与DNA损伤反应。Cdk的活性能促进DNA损伤诱导的ATM或ATR的激活［16］。这能够给相对于正常组织细胞恶性肿瘤细胞对基因毒性试剂更加敏感提供部分解释。

大量研究表明PIKKs的激活受特定的DNA序列和蛋白所调控，如NBS1对ATM的激活是必需的，TOPBP1对ATR的激活是必需的［17］。但是，DNA损伤反应中ATM与ATR的激活机制仍是未知的。因此可根据现有的研究设想DNA损伤诱导ERK激酶激活，ERK激酶再促进ATM和ATR的活化。

有报道称顺铂能强烈诱导卵巢癌细胞A2780 中ERK的活化，使用ERK活性抑制剂PD98059减少了顺铂诱导的p53 S15的磷酸化［18］。使用U0126抑制ERK活性减少了H9c2细胞中阿霉素诱导的p53 S15的磷酸化［19］。因S15不直接连接在脯氨酸之后，故ERK1/2不能直接磷酸化p53 S15。S15连接在QE之后，而S/TQE序列是ATM 和ATR的磷酸化位点，所以DNA损伤反应中的p53 S15是被ATM和ATR磷酸化激活的。由此推断，ERK激酶是通过促进ATM和ATR的激活进而增强p53 S15的磷酸化的。有类似的报道支持上述假设，在U87细胞中使用MEK抑制剂PD184352抑制ERK活性后，IR诱导ATM的S1981磷酸化形成的核焦点显著减少［20］。类似的观察结果也在MCF7细胞中发现，U0126减弱了IR诱导的ATR及ATR的下游靶酶包括CHK1的活化、CDC25和CDC2的失活［21］。考虑到ERK1/2作为MEK的主要靶酶，本课题组研究证实了敲除ERK1或ERK2能显著减弱ETOP诱导的ATM的激活（ATM S1981的磷酸化及磷酸化的ATM的核焦点），同时也减弱了ATM的底物的磷酸化，包括rH2AX的S139，p53 S15和CHK2的T68。CHK2通过磷酸化CDC25C的S216使CDC25C失活从而导致G2/M阻滞，敲除ERK1或ERK2能显著减弱MCF7细胞中ETOP诱导的CD25C S216的磷酸化并减弱ETOP诱导的G2/M检验点的阻滞［22］。

总之，DNA损伤反应、ERK1和ERK2都能参与调控细胞增殖。ERK不仅能促进细胞周期进程，也能通过依赖或不依赖于p53的机制、或处于ATM和ATR的下游、或促进ATM和ATR的活性来参与调控DNA损伤反应。

2.3ERK激酶调控DNA损伤反应具有细胞类型依赖性

ERK通路一般情况下主要由生长因子激活，但观察到当细胞受到各种基因毒性刺激（包括电离辐射、紫外线损伤、阿霉素、羟基脲、丝裂霉素C等）时，ERK也能被激活［23］。ERK激酶调控的检验点激活具有细胞类型依赖性。用MEK抑制剂（PD98059和U0126）和MEK1K97M能抑制ERK的活性，这能减弱许多细胞系中包括NIH3T3、MCF7、MEF和HCT116中依托泊苷和羟基脲诱导的G2/M和S期阻滞［23］。与此一致，敲除ERK1或ERK2基因也能减弱MCF7细胞中依托泊苷和羟基脲诱导的G2/M或S期阻滞［24］。相反，使用活性诱变剂MEK1Q56P能增强ERK1/2的活性，这能使HU诱导的S期检验点的激活更加敏感［25］。在果蝇细胞中发生的电离辐射诱导的检验点激活的内在原因是由于MEK-ERK通路的作用［26］。在足突状细胞中，cyb-9能诱导DNA损伤、细胞周期阻滞以及ERK的激活，抑制ERK活性能减弱细胞周期的阻滞［27］。在神经细胞中，MCC能激活ERK，这促进了MCC诱导的细胞凋亡［28］。同样，活性ERK也能促进NIH3T3细胞中ETOP诱导的细胞凋亡［23］，也能促进Hela细胞中顺铂诱导的细胞凋亡［29］，以及人的恶性胶质瘤T98G细胞中顺铂和UN诱导的细胞凋亡［30］。但是，也有报道称活性ERK抑制骨髓瘤细胞和白血病细胞中DNA损伤诱导的凋亡。在人的多种骨髓瘤细胞中，CHK1的抑制剂能诱导DNA损伤，同时激活ERK。抑制ERK的活性使MM细胞中Chk1的抑制剂UCN-01诱导的DNA损伤及凋亡更敏感［31］。同样，在急性粒细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）、NB4和HL60细胞中由阿糖胞苷诱导的DNA损伤中均有类似的报道［32］。此外，对于DNA损伤诱导的细胞周期阻滞后的细胞周期重启，活性ERK也有作用。KSR1是促进MEK调控ERK激活的一种支架蛋白，它在MMC诱导的ERK的激活中是必需的，去掉KSR1蛋白后使细胞在经历DNA损伤后不能重新进入细胞周期［33］。活性ERK调节HeLa细胞中阿霉素和ETOP诱导的葡萄糖转移酶3的上调［34］，也在电离辐射诱导的NF-κB的激活中发挥作用［35］。总之，大量研究结果证明ERK激酶在DNA损伤反应中发挥重要作用。

虽然损伤DNA诱导ERK激活的机制仍不清楚，但大量证据显示MEK激酶在DNA损伤反应中调控ERK激酶的活性，因为用MEK抑制剂（PD98059，U0126）、MEK siRNA抑制MEK活性后，能抑制各种基因毒试剂诱导的ERK的激活。然而，DNA损伤是否是通过Raf来激活MEK还有待研究。MMC在野生型而不是p53缺陷型MEFs中激活ERK，而ETOP在野生型和p53缺陷型MEFs中均诱导ERK激活。另外，顺铂和紫外线都能在缺乏功能性p53的人恶性胶质瘤T98G细胞中强烈激活ERK。因此，虽然在一定情况下p53可能对DNA损伤诱导ERK的激活有作用，但p53的功能在DNA损伤诱导的ERK的激活中可能不是必需的。这能解释至少一半的癌症患者表达突变型p53。ATM是电离辐射诱导DNA损伤反应的上游激酶，与此一致，有研究称U87细胞中电离辐射诱导的ERK的激活部分由ATM调控。类似的观察结果也可从光解诱导的双链损伤中获得。

3　展望

近年来开展的大量研究都证实了MEK/ERK激酶促进DNA损伤反应，然而对于DNA损伤信号是如何激活ATM和ATR的机制仍然是未知的，故对于DNA损伤信号如何激活ERK激酶的机制也是未知的。但是，基于大量研究表明ERK激酶在DNA损伤反应中起重要作用，阐明ERK激酶对DNA损伤反应的生理作用将把ERK-DDR的相关研究推进到一个新的水平。因为MEK/ERK激酶能促进ATM和ATR的激活，这增加了ERK激酶在DNA损伤反应调控中的重要性，因此需要阐明该潜在机制。使用特异性抑制剂阻断MEK的活性，使DNA损伤诱导的ATM和ATR的激活减弱，这说明ERK激酶促进ATM和ATR的激活。那么ERK是直接磷酸化ATM/ATR吗？还是磷酸化ATM/ATR活化所需的其它成分？这些磷酸化在ATM/ATR的活化中有作用吗？这些问题都有待解决。

本课题组研究发现HU强烈诱导ATR的S428磷酸化，且在敲除ERK1和ERK2基因后此事件显著减弱。磷酸化S428的酶和此事件对ATR功能的影响均是未知的。S428直接位于脯氨酸之后，此位点能与ERK激酶的特异性底物匹配。此外，ERK激酶在DNA损伤调控中的生理相关性将进一步在基因敲除的小鼠中进行检测。

虽然化疗药物通常能诱导DNA损伤，ERK途径的小分子抑制剂也被积极探索用于癌症治疗。联合使用基因毒性药物和ERK激酶抑制剂用于治疗癌症的想法还需要谨慎考虑。因为ERK促进DNA损伤反应，可以设想上述联合疗法可能引起DNA损伤的积累。这将增强化疗药物的遗传毒性效应的敏感性。然而，另一方面，抑制ERK激酶的活性可能会使检验点的激活减弱因此使有DNA损伤的细胞增殖。这可能会导致突变并形成二级癌症。因此，更好的了解ERK激酶在DNA损伤反应中的作用，将为优化这种联合疗法做好准备。

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The mechanism of ERK1/2 kinases facilitate DNA damage response

WEI Fengxiang1，3，ZHANG Lei1，WANG Shaojuan2★
（1.The Genetics Laboratory，Longgang District Maternity and Child Healthcare Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518172；2.Department of Obstetrics and Gynecology，Longgang District Renmin Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518172；3.Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou，China，563003）

［ABSTRACT］The DNA damage response（DDR）helps to maintain genome integrity，and a critical event in this process is the prevention of cell division by activating the checkpoint until the DNA lesions can be repaired.The extracellular signal-regulated kinase（ERK）/mitogen-activated protein kinase（MAPK）pathway is a classic pathway for signal transduction and possesses multiple functions in regulating cellular proliferation，differentiation，and apoptosis.The functional connection between the DDR and ERK is the regulation of cell proliferation.This review aims to describe our current understanding of the function of ERK kinases in DDR.

［KEY WORDS］DNA damage response（DDR）；Extracellular signal-regulated kinases（ERK1/2）；Cell cycle arrest；ATM；ATR

基金项目：国家自然科学基金（81201568）；深圳市海外高层次人才创新创业项目（KQCX20120814150420241）；深圳市科技计划重点项目（201201009）

作者单位：1.深圳市龙岗区妇幼保健院中心实验室，广东，深圳518172 2.深圳市龙岗区人民医院妇产科，广东，广州518172 3.遵义医学院，贵州，遵义563003