Gilbert综合征及Crigler-Najjar综合征诊断方法

刘雪梅　骆子义



Gilbert综合征及Crigler-Najjar综合征诊断方法

刘雪梅骆子义★

［摘要］先天性高非结合胆红素血症包括Gilbert综合征（Gilbert syndrome，GS）和Crigler-Najjar综合征（Crigler-Najjar syndrome，CNS），目前研究表明其发病机制是尿甘二磷酸葡糖醛酸转移酶1A1 （UDP-glucuronosyl transferase 1A1，UGT1A1）基因多态性导致酶的缺乏或活性降低，导致胆红素代谢障碍。GS和CNS的诊断依赖UGT1A1的基因突变位点检出。分子诊断是基因诊断的重要方式。本文就UGT1A1基因检出方法研究进展作一综述。

［关键词］Gilbert综合征；Crigler-Najjar综合征；UGT1A1；基因诊断；基因多态性

★通讯作者：骆子义，E-mail：13501569621@163.com

Gilbert综合征（Gilbert syndrome，GS）1901年最先被Gilbert和Lereboulet［1］报道，是一种具有家族性的先天性血清高胆红素血症，其血清总胆红素水平为（1～6）mg/dL［（17.1～102.6）μmol/L］。Bosma等［2］报道GS的发病率为3%～7%，其在任何年龄均可发病，以男性多见。Crigler-Najjar综合征（Crigler-Najjar syndrome，CNS）在1952年被Crigler和Najjar［3］报道，多见于新生儿，但其发病率极低，在100万新生儿中约有1例［4］。1962年Arias等［5-6］提出CNS实际可以分为2型，即CNS-I［血清总胆红素水平为（30～50）mg/dL（513～855）μmol/L］和CNS-II［血清总胆红素水平为（6～20）mg/dL （102.6～342）μmol/L］。GS和CNS是未结合型高胆红素血症的2种表现形式，目前研究认为，尿甘二磷酸葡糖醛酸转移酶1A1（UDP-glucuronosyl transferase 1A1，UGT1A1）基因多态性对其发病有显著影响。UGT1A1存在多态性导致酶的缺乏或活性降低，从而导致胆红素代谢障碍［7］。而多种药物亦有抑制UGT1A1活性的作用［8］，若用药过程同时存在UGT1A1多态导致酶活性降低，则有用药安全隐患。一直以来，GS作为一种良性疾病，并不需要特殊相关治疗，而重点在于确立诊断并与其他原因引起的肝脏损害性疾病区分开来，为临床用药和遗传咨询作出积极参考，因此GS的诊断是临床研究的重要内容。本文就GS的诊断研究进展作如下综述。

1　UGT1A1多态性

UGT1A1基因在1991年被首次克隆［9］，GS、CNS-Ⅰ及CNS-Ⅱ中有大量突变点，目前被报道的UGT1A1基因突变有130种［10］，有91种为单核苷酸替换突变，21种为单核苷酸缺失，10种为单核苷酸插入，其余8种表现为基因启动子和内含子中。多数GS患者突变在启动子、增强子及编码区，UGT1A1酶的活性低于正常的30%［11］；大多数CNS-Ⅱ患者存在纯合子错义突变和多位点复合突变，导致酶的活性低于正常酶活性的10%［12］；而CNS-Ⅰ患者UGT1A1酶的活性则完全缺失。

2　基因诊断方式研究

2.1基因组直接测序

DNA测序是GS及CNS诊断的金标准，有直接测序和间接测序。直接测序是基因测序中最常用的方法，选取需要检测的突变位点，根据UGT1A1多态性设计引物，提取全血基因组，以DNA为模板进行PCR扩增后直接测序［13］。目前基因组测序主要有第二代测序技术及第三代测序技术。第二代测序技术的基本原理是边合成边测序，通过捕捉新合成的末端标记来确定DNA序列；第三代测序技术主要有分子荧光测序及纳米孔测序，与第二代相比，测序速度及精确度更高，不但可以直接测序DNA，还可以测序甲基化的DNA。基因测序方法虽可准确检测出突变位点，明确诊断，但操作费时、测序机器昂贵、耗费大、效率低，不适于大规模临床诊断应用。

2.2基因间接测序

此法主要有变性高效液相色谱（denaturing high performance liguld chromatography，DHPLC），变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gelelectrophresis，DGGE）、PCR-单链构象多态性（polymerase chian reaction-single-strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）［14］。DHPLC的原理：在控制升高温度的条件下，部分解链及解链的DNA会有不同的性质，杂合子个体的DNA经PCR扩增后产生异源双链，纯合子DNA则产生同源双链。但二者解链特征不同，在变性温度下，异源双链较同源更易解链形成Y型结构，而在洗脱温度时，单链片段分子的负电荷与双链相比较少，故更早洗脱。由于异源双链PCR产物比同源双链含有更高的单链的比例，保留时间更短，因此异源双链较同源双链较早洗脱。突变的样品呈异源及同源双链混合物的峰型特点，未突变者则只有同源双链峰型特点。此技术的关键在于解链温度的控制及色谱柱的分离性能，其不但可以检测已知突变，还可检测未知突变。且与其他传统的杂合双链分析技术相比，耗时较短，自动化提高，可在几分钟内分析一个样品，无需使用凝胶剂放射性同位素；但其劣势在于高效液相色谱仪器价格昂贵［15］。PCR-SSCP的原理是：根据DNA序列设计相应引物，用PCR扩增靶向序列后将扩增片段变性为单链，由于单链DNA在中性条件下根据其碱基不同自身会折叠成不同的具有一定的空间结构的构象，因此，相同长度的单链DNA所形成的构象不同，迁移率也不同。在此基础上，被PCR扩增变性为单链DNA的片段在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，由于产物DNA含单个碱基置换、插入或缺失，会发生迁移率的改变，从而影响电泳的位置改变，区分出变异DNA与正常的DNA，以此检测微小到一个基因突变的差异。此法是比较灵敏的检测技术，但研究认为，此方法在RNA的检出率明显高于DNA，原因可能是DNA次级结构较相对RNA稳定，可变性较小，若发生突变，构象变化也较小，导致迁移率改变不明显［16］。DGGE的原理主要是基于突变型和野生型核酸序列的不同而导致其变性浓度的差异，在聚丙烯酰氨凝胶电泳的基础上加变性剂尿素或甲酰胺等区分同样长度的DNA片段，此方法最初是用来检测点突变。不同的DNA片段碱基组成差异导致其解链浓度不同，其中主要是GC碱基的含量影响DNA双链的解链区域及解链行为。当变性浓度达到最低的解链区域时，该区域的序列解链，解链部分的DNA片段在凝胶中的迁移率会急剧下降。同样长度的DNA片段序列不同，其在凝胶中达到最低解链浓度的位置也不同，因此可以被区分出来。本技术经过发展，已衍生出温度梯度凝胶电泳、恒定变性凝胶电泳、瞬时温度梯度电泳等改良技术［17］。这种方法和PCR技术相结合被广泛应用于各种突变分析。澳洲学者［18］利用双变性梯度凝胶电泳检测Gilbert综合征患者DNA样本，可以快速检测出TA插入异常，并能区分出TA杂合子和TA纯合子。以上方法均是对基因组进行初步筛选后，对阳性标本进行测序，相比直接测序而言耗费较少，操作也较简化，但总体来说，用于大量标本检测仍较耗时。

2.3基因芯片技术

本技术的基本原理是杂交原理，将探针固定在芯片预先设定的区域内，形成DNA微队列，PCR扩增后的片段产物与芯片通过碱基配对原理进行杂交。反应结果用化学荧光、化学发光或同位素法标记，通过检测杂交信号的强弱并进行计算机分析，从而检测对应片段或某个位点的等位基因是否存在，以发现单核苷酸的插入、缺失、变换等。基因芯片自发展以来，多用于扫描全基因组、基因功能的研究和疾病临床检测及诊断等多方面。有研究把基因芯片中加入特异性探针对108例GS患者的UGT1A1启动子进行分析，成功识别其常见及罕见突变点，基因测序结果证实其准确率达100%［19］。基因芯片技术具有灵敏、准确、高通量及高自动化等优点，是比较可靠而有前途的基因诊断技术，但其芯片制作成本昂贵、技术复杂，重复性差、分析范围狭窄等缺点尚需改革。

2.4内切酶酶切技术

在UGT1A1的诊断中用到的主要是聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymersae chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术，PCR-RFLP的基本原理是：用PCR扩增目标DNA序列，然后用限制性内切酶酶切目的片段，内切酶识别并切割相应的序列片段，酶切产物进行电泳，根据对比酶切图谱及片段多样性特点，分析不同基因序列差异，不同的等位基因酶切位点不同，酶切产物电泳条带也不同。聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术操作简单，基因分型的时间较短，目的DNA的含量和相对特异性都大大提高。有学者［20］提出用此检测UGT1A1基因编码的外显子1的突变点211G＞A，准确性高，且与RFLP相比，以扩增替代了酶切，不需要克隆基因作探针，不依赖Southern blot技术，避免了RFLP繁琐的DNA酶切、转移、杂交等步骤。本项技术进过改良，可以同过添加创造酶切位点来提高酶切准确性，但其缺点是酶切位点的选择较复杂、缺乏效率，且可能会由于酶切不完全等原因出现假阳性结果，多重酶切分析难度增加，难以实现高通量检测。

2.5实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）技术

本项技术以荧光共振能量传递（fluorescence resonance energy transfer，FRET）为基础，包括探针类和非探针类，探针类特异性较高，是基因突变检测的常用类型，探针类型中最常用的是TaqMan探针，TaqMan探针属于一种寡核苷酸探针，其序列只有一个碱基的差异，探针设计为与目的序列上下游引物之间的碱基配对，根据荧光探针的杂交原理，将目的DNA进行PCR扩增。探针完整时，荧光基团与淬灭基团分别在探针5′末端和3′末端，淬灭基团吸收荧光，故不会有荧光发出；PCR扩增时，产物与探针相结合，Taq外切酶活性将探针酶切降解，随着荧光基团和淬灭剂分离，荧光基团在激发光的作用下发出荧光，PCR扩增与荧光信号累积完全同步，故荧光强度越高，扩增产物的数量越多，可在优化体系的条件下使用多重荧光定量PCR。此技术的优点在于简便、准确、快速及污染小、无需DNA测序，并可实现大通量检测。而缺点在于此法是对已知基因突变的检测，引物及探针的设计都要依据已知DNA序列而定，目前已知UGT1A1基因的突变位点有130个之多，而探针价格昂贵，临床中只能选择常见突变点做检测，在诊断时易忽略其他突变位点可能对检测目标水平的影响，且所设计的探针仅有一个碱基的差异，检测结果不能排除假阳性可能。

2.6高分辨率熔解曲线（high resolution melting curve，HRM）分析技术

HRM技术是近年来国内外最新的分子诊断研究工具，其概念早在上世纪70年代提出［21］，是根据DNA特征性熔解曲线来研究DNA特征而发展起来的研究方法。此方法多为非探针标记，非探针标记的HRM是用特定的荧光染料插入DNA双链中［22］，DNA熔解曲线的变化取决于扩增子序列的特异性，依据序列GC含量不同和碱基互补差异，在PCR升温过程中，双链DNA不互补的位点会先解链，荧光染料从解链的DNA上释放出来，随着PCR的扩增，可以通过荧光强度和时间曲线与标准品的比较来分辨是否有基因突变。其特点是无需设计使用特异性探针，只要设计一对相应引物就可以分析等位基因的突变，同时HRM检测不受碱基位点和种类的局限，因此，对已知突变和未知突变都能进行筛查分析。有研究者［22］用HRM技术对110名健康受试者全血提取DNA后进行UGT1A1启动子和11个外显子筛选，结果不仅确定了5个已知的变种的UGT1A1，还识别出8个未知的序列变异，并与基因组直接测序结果完全相符。也有人［23］用本技术有效诊断GS的TATA盒变异。此技术对诊断GS的UGT1A1突变，特别是TATA盒及G211A位点突变敏感性及特异性良好，有相当于直接测序的准确性，适用于亚洲人Gilbert综合征的诊断［24］。此外，HRM已广泛用于临床病毒耐药或细菌基因突变的扫描及发现［25］、基因序列匹配［26］、甲基化筛查［27］、基因分型［28］等各个方面，技术水平越来越成熟。虽然HRM对目的片段长度有限制，对温度均一性及仪器精密度要求较高，使结果不够稳定，但随着仪器和荧光染料的不断改良，以及本项技术不断进步，与其他技术联合使用亦是未来发展趋势。有研究表明通过与实时荧光PCR技术结合应用，可提高其精确性和稳定性［25］。目前各方面的研究表明，HRM具有灵敏度高、特异性强、简单快速、高效、成本低廉、高通量、闭管操作、无PCR反应后电泳、测序等后续处理等优点，有望成为临床基因分子诊断常规检查技术。

3　结语与展望

GS和CNS作为一种常染色体隐性遗传性疾病，肝脏无器质性病变，以血清非结合型胆红素间歇性升高为主，临床一般表现为皮肤巩膜黄染、上腹部不适等消化道症状。血清胆红素达GS或CNS的诊断水平值，排除肝炎等明确因素及其他遗传性疾病，结合基因突变位点的检出，苯巴比妥治疗有效等可作出临床诊断。由于经济条件的限制，基因突变的检出较难施行，临床常依靠苯巴比妥试验、利福平试验、肝组织活检等来协助诊断，不能完全确诊。目前基因诊断方式或因操作繁杂、效率低，或因试剂、机器价格昂贵，阻碍了临床有效应用。因此，随着基因分子诊断研究进步，新的高灵敏高特异性、简单快速、低成本、自动化、可大量施行的检测方式亟待开发。

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Diagnostic methods in Gilbert and Crigler-Najjar syndromes

LIUXuemei，LUOZiyi★
（Department of Digestive Disease，the Third People’s Hospital affiliated to of Guangdong Medical College，Shenzhen，Guangdong，China，518020）

［ABSTRACT］Congenital unconjugated hyperbilirubinemias include Gilbert syndrome（GS）and Crigler-Najjar syndrome（CNS）.The present study indicates that the pathogenesis of the disease is the gene polymorphism of UDP-glucuronosyl transferase 1A1 gene（UGT1A1）leading to absence or lack of enzymatic activity，resulting in bilirubin metabolism disorders.Diagnosis of GS and CNS depend on the detection of UGT1A1 gene mutations.In this article，the progress of UGT1A1 gene detection methods will be reviewed.

［KEY WORDS］Gilbert syndrome（GS）；Crigler-Najjar syndrome（CNS）；UGT1A1；Gene diagnosis；Gene polymorphism

作者单位：广东医学院附属深圳市第三人民医院消化内科，广东，深圳518020