MK801对结肠癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响

谢冬冰，孟建宇，郭玉婷，任霞，李雪

MK801对结肠癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响

谢冬冰1，孟建宇2，郭玉婷3Δ，任霞4，李雪1

目的探究N-甲基-D-天冬氨酸受体亚型1（NMDAR1）在结肠癌细胞HT29和SW116中的表达，以及NMDAR1拮抗剂MK801对HT-29和SW116细胞生长抑制、凋亡和迁移的影响。方法采用免疫组织化学法检测结肠癌细胞HT-29和SW116细胞表面NMDAR1的表达；应用噻唑蓝（MTT）比色法测定62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0、2 000.0 μmol/L的MK801对于HT-29和SW116细胞增殖作用的影响；应用流式细胞术检测2 000 μmol/L的MK801对HT29和SW116细胞凋亡的影响；应用细胞划痕实验检测50 μmol/L MK801对于结肠癌细胞HT-29和SW116迁移能力的影响。结果结肠癌细胞HT-29和SW116均表达NMDAR1，且主要表达于细胞质中；各浓度的MK801对HT-29细胞，以及浓度为500.0、1 000.0、2 000.0 μmol/L的MK801对SW116细胞的生长抑制作用具有时间效应关系，24、48及72 h各MK801浓度组对HT-29和SW116细胞的抑制率随浓度升高整体呈增强趋势，但抑制率不呈明显的剂量效应关系；MK801具有促进HT-29和SW116细胞凋亡的作用，且主要表现诱导细胞早期凋亡；MK801可抑制HT-29和SW116细胞迁移。结论NMDAR1在结肠癌细胞胞质中表达，且NMDAR1拮抗剂MK801具有抑制肿瘤细胞生长、迁移，促进其早期凋亡的作用，有望成为新一代抗肿瘤药物。

结肠肿瘤；细胞增殖；细胞凋亡；细胞运动；体外研究；N-甲基-D-天冬氨酸受体亚型1；MK801；HT-29；SW116

脑肠肽是指在胃肠道和神经系统双重分布的肽类［1］。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统主要的兴奋性氨基酸,谷氨酸受体可分为离子型受体和G蛋白偶联的代谢型受体两大类［2］。N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartate，NMDA）受体（NMDAR）为主要的离子型受体，其由NR1、NR2和NR3等亚基组成。NR1是NMDAR1的功能部分,构成离子通道［3］。近年来，越来越多的研究表明，NMDAR不仅在神经系统发育、疼痛感觉等中发挥着重要的作用,而且也参与了胃肠道组织细胞的增殖，被视为一种脑肠肽［4］。研究显示，NMDAR拮抗剂能抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞的凋亡［5］。然而，有关NMDAR及其拮抗剂对于结肠癌作用的报道较少。MK801为非选择性NMDAR1拮抗剂，本文通过分析MK801对于结肠癌细胞HT-29及SW116增殖、凋亡、迁移作用的影响，探讨MK801用于结肠癌治疗的可行性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器人结肠癌细胞株HT-29、SW116（中科院基础研究所，上海），MK801（MCE公司，美国），胎牛血清、DMEM培养基（Hyclone公司，美国），McCOY 5a培养基（吉诺生物医药技术有限公司），胰蛋白酶-EDTA消化液、噻唑蓝（MTT，Solarbio公司，中国），Rabbit Anti-NMDAR1、超敏二步法免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），流式检测凋亡试剂盒AnnexinV-FITC Apoptosis DetectionKit I（BD公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人结肠癌HT-29细胞用McCOY 5a培养基，SW116细胞用DMEM培养基。培养基中均加入10%胎牛血清，同时加入100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素，接种至细胞培养瓶后，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.2 免疫组织化学法检测HT-29及SW116细胞表面NMDAR1的表达分别取对数生长期的HT-29和SW116细胞分别接种于24孔板，每种细胞均分为实验组和对照组，培养24 h待细胞贴壁后，吸弃培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗细胞2次，5 min/次，加入4%多聚甲醛固定15 min，吸弃，PBS洗3次；加入0.3%的TritanX-100细胞打孔，室温10 min，吸弃，PBS洗3次；加入3%H2O210 min以灭活内源性酶，吸弃，PBS洗3次；加入5%BSA室温封闭30 min，吸弃。实验组加入NMDAR1抗体，4℃孵育过夜。对照组用PBS代替NMDAR1抗体。次日吸弃，PBS洗3次；加入二抗孵育30 min，吸弃，PBS洗4次；加入DAB试剂显色5 min，PBS终止，流水冲10 min，苏木精染核30 s，流水冲洗，1%乙醇盐酸返蓝，流水冲10 min，依次过体积分数85%、90%、95%、100%乙醇，二甲苯2次脱水，封片胶封片。显微镜下观察细胞染色情况，以细胞膜及细胞质染色为棕黄色至棕褐色为阳性反应。

1.2.3 MTT比色法检测MK801对HT-29和SW116细胞生长抑制的影响分别取处于指数生长期的HT-29和SW116细胞用胰酶进行消化,调整细胞浓度为1×105个/mL，以每孔100 μL接种于96孔板，培养24 h后弃去培养基，分别加入用培养基配置的浓度为62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0、2 000.0 μmol/L的MK801，以不加药物处理的细胞为对照组，继续培养24、48、72 h后，每孔加入5 g/L MTT 10 μL，并设置空白孔，37℃避光孵育4 h,弃去培养液,每孔加入100 μL的二甲基亚砜（DMSO），振荡15 min，酶标仪检测波长为492 nm的光密度（OD）值。计算细胞生长抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。本实验每次设置3个复孔，重复实验3次。

1.2.4 流式细胞仪检测MK801对HT-29和SW116细胞凋亡的影响参照Annexin V细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。HT-29和SW116细胞经2 000 μmol/L的MK801处理24 h，以未经药物处理的细胞为对照组，每组收集1×106个细胞，冷PBS洗涤2次，1 000 r/min离心3 min，弃上清液。将细胞重悬于500 μL的1×binding buffer，调整细胞浓度为1×106个/mL，取100 μL细胞置于流式细胞仪专用试管中，加5 μL AnnexinV FITC，避光室温反应15 min，加入5 μL碘化丙啶（PI）轻轻混匀,再加入400 μL 1×binding buffer，过滤膜，流式细胞仪检测凋亡情况。实验重复3次取平均值。

1.2.5 细胞划痕实验检测HT-29和SW116细胞体外迁移能力调整细胞密度为5×106个/mL，以每孔1 mL接种到12孔板上，培养24 h待细胞贴壁后，用10 μL枪头在孔板中央划1条宽度均一的划痕，PBS洗2遍以除去划下的细胞，加入培养基配置的50 μmol/L的MK801，以不加药物的培养基为阴性对照，拍照取样，记录划痕的位置。继续培养48 h，取相同位置拍照取样，用Pro-Plus软件计算细胞迁移前后划痕距离，并计算细胞迁移率=（迁移前距离-迁移后距离）/迁移前距离×100%，实验重复3次。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，所有计量资料以表示，2组间比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HT-29及SW116细胞中NMDAR1的表达情况NMDAR1在结肠癌HT-29和SW116细胞中均呈阳性表达，且主要表达于细胞胞质中，表现为细胞质中染色为棕黄色至棕褐色，而对照组仅表现为核染色，见图1。

2.2 MK801对HT-29及SW116细胞的生长抑制作用（1）组内随时间变化：除对照组外，各MK801浓度组对HT-29细胞的生长抑制率随时间延长呈增强趋势，而SW116细胞仅500.0、1 000.0及2 000.0 μmol/L组细胞生长抑制率随时间延长呈增强趋势，细胞生长抑制率具有时间效应关系（P＜0.01），见表1、2。（2）各时点组间比较：24、48及72 h各MK801浓度组对HT-29和SW116细胞的生长抑制率随浓度升高整体呈增强趋势，但组间多重比较差异并非全部有统计学意义，抑制率不呈明显的剂量效应关系，见表1、2。

Tab.1The inhibitory effects of MK801 on the growth of HT-29 cells表1 MK801对HT-29细胞生长抑制的作用（n=3,%，）

Tab.1The inhibitory effects of MK801 on the growth of HT-29 cells表1 MK801对HT-29细胞生长抑制的作用（n=3,%，）

＊＊P＜0.01，a～f分别表示与对照组、62.5、125.0、250.0、500.0及1 000.0 μmol/L组比较，P＜0.05；A、B分别表示与24、48 h组比较，P＜0.05，表2同

组别对照组实验组（μmol/L）62.5 125.0 250.0 500.0 1 000.0 2 000.0 F 24 h 0 48 h 0 72 h 0 F 8.40±3.30 24.58±1.66a 37.83±10.12ab 45.36±6.99abcd 75.60±2.74abcde 84.57±1.55abcdef 122.43＊＊27.09±6.30aA 49.29±7.44abA 69.77±3.65abA 89.02±1.22abcdA 90.55±1.35abcdeA 95.68±0.27abcdeA 248.55＊＊46.11±2.29aAB 72.75±0.26abAB 90.88±0.61abcAB 97.03±0.37abcdA 97.79±0.59abcdAB 98.83±0.25abcdAB 4 579.51＊＊57.15＊＊89.71＊＊55.28＊＊137.76＊＊118.54＊＊197.88＊＊

Tab.2The inhibitory effects of MK801 on the growth of SW116 cells表2 MK801对SW116细胞生长抑制的影响（n=3,%，）

Tab.2The inhibitory effects of MK801 on the growth of SW116 cells表2 MK801对SW116细胞生长抑制的影响（n=3,%，）

组别对照组实验组（μmol/L）62.5 125.0 250.0 500.0 1 000.0 2 000.0 F 24 h 0 48 h 0 72 h 0 F 4.28±0.76a 13.83±2.05ab 18.91±1.42abc 24.58±2.14abcd 49.09±2.34abcde 78.58±1.08abcdef 901.58＊＊7.81±3.49a 12.97±3.56a 23.16±2.67abc 50.60±2.42abcdA 66.32±4.73abcdeA 79.41±1.64abcdefA 321.24＊＊6.76±1.90a 10.97±2.63a 23.04±2.26abc 45.33±2.88abcAB 80.79±1.66abcdeAB 84.36±1.56abcdeAB 885.579＊＊1.80 0.81 3.68 90.86＊＊73.95＊＊73.95＊＊

2.3 MK801对HT-29和SW116细胞凋亡的影响HT-29和SW116细胞中，实验组凋亡率均明显高于对照组（P＜0.01），且主要为早期凋亡，见图2、表3。

Fig.2The effects of MK801 on apoptotic rates of HT-29 and SW116 cells detected by Annexin V/propidium iodide staining图2 MK801对结肠癌HT-29、SW116细胞凋亡的影响

Tab.3Effects of MK801 on apoptosis and migration of HT-29 and SW116 cells表3 MK801对HT-29和SW116细胞凋亡和迁移能力的影响（n=3,%，）

Tab.3Effects of MK801 on apoptosis and migration of HT-29 and SW116 cells表3 MK801对HT-29和SW116细胞凋亡和迁移能力的影响（n=3,%，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

迁移率51.92±1.78 37.59±2.79 7.48＊＊组别对照组实验组t HT-29凋亡率2.80±0.20 65.67±0.81 129.83＊＊SW116凋亡率1.80±0.20 53.56±0.77 111.78＊＊迁移率25.25±2.77 15.14±3.19 4.14＊

2.4 MK801对HT-29细胞和SW116细胞迁移能力的影响HT-29细胞及SW116细胞中，实验组的迁移率均低于对照组（P＜0.05），见表3、图3。

Fig.3Effects of MK801 on migration of HT-29 and SW116 cells（×100）图3 MK801对HT-29和SW116细胞迁移能力的影响（×100）

3 讨论

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，美国2016年的癌症数据显示，结直肠癌在癌症发病率中位列第4，在癌症导致的死亡率中位于第2［6］。研究显示，在我国结直肠癌平均每年新发病例可达37.6万例，占全部恶性肿瘤发病的8.7%，居第5位；每年死于该病的患者有19.1万例，占由癌症导致死亡人数的6.7%，居第5位［7］。虽然伴随着分子生物技术的发展，对于结直肠癌的手术、化疗、放疗及分子靶向治疗方面取得了很大进展，但晚期患者由于发生多处转移，治愈率仍较低［8-9］。

NMDAR是兴奋性神经递质谷氨酸的离子型受体,主要存在于中枢神经系统中［1］。既往研究表明，NMDAR抑制剂对于肿瘤细胞具有抑制作用［10］；而在消化道肿瘤的研究中，Watanabe等［11］研究表明，NMDAR可在胃癌细胞中表达，并且NMDAR拮抗剂能抑制胃癌细胞的增殖。Kim等［12］研究认为NMDAR拮抗剂能抑制食管癌的增殖。

本研究细胞免疫组织化学结果显示，HT-29细胞及SW116细胞胞质染色为棕黄色至棕褐色，表明结肠癌HT-29细胞及SW116细胞胞质中表达NMDAR1。细胞增殖实验显示，各浓度的MK801对HT-29细胞，以及浓度为500.0、1 000.0、2 000.0 μmol/L的MK801对SW116细胞的生长抑制作用具有时间效应关系，24、48及72 h各MK801浓度组对HT-29和SW116细胞的抑制率随浓度升高整体呈增强趋势，但抑制率不呈明显的剂量效应关系。细胞凋亡实验显示，实验组的凋亡率明显高于对照组，且主要表现为诱导细胞早期凋亡。细胞迁移实验显示，HT-29细胞及SW116细胞中，实验组的迁移率均低于对照组，表明MK801可抑制细胞迁移。该结果与Watanabe等［11］、Kim等［12］的研究结果相符。

另有研究认为，高浓度的Ca2+能促进肿瘤细胞的增殖，对于肿瘤细胞分化至关重要，而Ca2+对肿瘤细胞的形成过程也起着重要作用，并且影响细胞迁移［13］。本研究结果表明，NMDAR1在肿瘤细胞胞质中表达，并且NMDAR1拮抗剂MK801能抑制细胞的增殖、迁移，并促进细胞早期凋亡，而NMDAR1抑制剂的作用机制主要是通过抵抗细胞内的Ca2+浓度，从而降低肿瘤细胞Ca2+浓度，起到抑制细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡的作用，因此，笔者认为MK801对肿瘤细胞的作用机制可能与Ca2+通道或Ca2+调节酶有关。

综上所述，谷氨酸离子型受体NMDAR1不仅在神经系统中表达，在外周组织细胞中亦有表达，可视为一种脑肠肽［1］，而NMDAR1拮抗剂MK801对肿瘤细胞具有生长抑制作用，且可抑制肿瘤细胞迁移，并促进细胞早期凋亡，故其可能成为新一代的抗肿瘤药物，为临床治疗提供新途径。

（图1见插页）

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（2016-06-14收稿2016-07-13修回）

（本文编辑陆荣展）

Effects of MK801 on proliferation,apoptosis and migration of colorectal cancer cells

XIE Dongbing1,MENG Jianyu2,GUO Yuting3Δ,REN Xia4,LI Xue1
1 The Second Clinical College of Shandong University of TCM,Jinan 250014,China;2 The Institute of Technology of Shandong University of TCM;3 Department of Gastroenterology,the Second Affiliated Hospital of Shandong University of TCM;4 The Academy of Medical Science of Shandong Province△

ObjectiveTo explore the expression of the N-methyl-D-aspartate receptor type 1(NMDAR1)in the colorectal cancer cells(CRC),and to examine the effects of NMDAR1 antagonists MK801 on proliferation,apoptosis and migration of colorectal cancer cell line HT-29 and SW116 cells.MethodsThe immunocytochemistry method was used to examine the expressions of NMDAR1 in HT-29 and SW116 cells.MTT assay was used to detect the effects of MK801(62.5, 125.0,250.0,500.0,1 000.0,2 000.0 μmol/L)on the proliferation of HT-29 and SW116 cells.The flow cytometry was used to analyze the effect of MK801(2 000 μmol/L)on cell apoptosis of HT-29 and SW116 cells.Wound healing assay was used to detect the effect of MK801(50 μmol/L)on the migration of HT-29 or SW116 cells.ResultsThe NMDAR1 was expressed in both HT-29 and SW116 cells,and mainly in the cytoplasm.MTT assay showed that there were inhibitory effects of different concentrations of MK 801(62.5,125.0,250.0,500.0,1 000.0,2 000.0 μmol/L)on the proliferation of HT-29 cells,and inhibitory effects of different concentrations of MK801(500.0,1 000.0,2 000.0 μmol/L)on SW116 cells,in a time-dependent manner.For 24,48 and 72 h,the inhibitory effects of MK801 on proliferation rates of HT-29 and SW116 cells were increased with the increased concentrations of MK801.MK801 showed an effect to induce cell apoptosis in HT-29 and SW116 cells,and mainly for early apoptosis.Wound healing assay indicated that MK801 inhibited the cell migration of HT-29 and SW116 cells.ConclusionResults suggest that there is expression of NMDAR1 in colorectal cancer cells. The NMDAR1 antagonist MK801 can inhibit the proliferation,induce cells early apoptosis and inhibit cells migration.It maybe a new generation of antitumor drugs.

colonic neoplasms；cell proliferation；apoptosis；cell movement；in vitro；N-methyl-D-aspartate receptor subtype 1；MK801；HT-29；SW116

R735.35

A

10.11958/20160486

山东省自然科学基金资助项目（Y2008C141）

1山东中医药大学第二临床学院（邮编250014）；2山东中医药大学理工学院；3山东中医药大学附属第二医院消化科；4山东省医学科学院基础所

谢冬冰（1990），女，硕士在读，主要从事消化道疾病诊治的研究

Δ通讯作者E-mail:zhmqlw@sina.com