增塑剂邻苯二甲酸二异壬酯致小鼠肺细胞氧化损伤作用的研究

马萍,李金泉，晏彪，刘旭东，廖文莉，杨旭，武阳,*

1. 湖北科技学院基础医学院环境生物医学实验室，咸宁 437100 2. 华中师范大学生命科学学院环境生物医学实验室，武汉 430079



增塑剂邻苯二甲酸二异壬酯致小鼠肺细胞氧化损伤作用的研究

马萍1,2,李金泉2，晏彪2，刘旭东2，廖文莉1，杨旭2，武阳1,2,*

1. 湖北科技学院基础医学院环境生物医学实验室，咸宁 437100 2. 华中师范大学生命科学学院环境生物医学实验室，武汉 430079

为研究增塑剂邻苯二甲酸二异壬酯(diisononyl phthalate, DINP)对小鼠肺组织的氧化损伤作用，以昆明小鼠为受试动物，随机分为5组，包括1个阴性对照组(生理盐水)和4个DINP染毒组(0.2、2、20和200 mg·kg-1)，灌胃14 d。光镜下发现小鼠肺组织形态随染毒剂量的增加，小鼠肺细胞的病理损伤越严重。随着DINP染毒剂量的增加，肺组织匀浆活性氧(reactive oxygen species, ROS)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和肺组织细胞DNA-蛋白质交联(DNA-protein crosslink, DPC)系数逐渐上升，还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量逐渐降低，各指标呈一定的剂量-效应关系。染毒剂量为20 mg·kg-1时，ROS和MDA含量差异有统计学意义(P< 0.05，P< 0.01)；染毒剂量为200 mg·kg-1时，上述指标差异均有统计学意义(P< 0.01)。结果表明，较高剂量(≥20 mg·kg-1)的DINP能造成小鼠肺组织的氧化损伤和病理损伤。

邻苯二甲酸二异壬酯；小鼠；活性氧；还原型谷胱甘肽；丙二醛；DNA-蛋白质交联；氧化损伤

Received 24 August 2015 accepted 23 October 2015

增塑剂可以增加塑料制品的柔韧性和拉伸性，是现代塑料工业最大的助剂品种。国内增塑剂市场多年来都由邻苯二甲酸酯类增塑剂所主导，种类约占增塑剂总类的90%[1]，其中以邻苯二甲酸二乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate, DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)和邻苯二甲酸丁苄酯(benzylbutyl phthalate, BBP)最为常用。研究表明DEHP、DBP和BBP进入体内后可与性激素受体竞争性结合，干扰血液中性激素正常水平的维持，主要表现为男童睾丸发育不全、隐睾、阴茎短小，女童乳房发育早熟等[2-3]。为了规避这种生殖发育毒性作用，欧盟成员国已经严格限制这3种增塑剂在有关制品中的含量(欧盟2005/84/EC指令)：“DEHP、DBP及BBP含量超过0.1%的玩具及儿童护理用品，不得在欧盟市场出售”[4]。同时一批高分子量增塑剂开始得到各国广泛的应用，邻苯二甲酸二异壬酯(diisononyl phthalate, DINP)就是其中的一种[5]。

DINP可通过口服、皮肤接触和吸入等途径进入人体，其中经饮食进入是最主要的暴露途径[6]。Kaufmann等[7]发现DINP在大鼠体内能诱导过氧化物酶的生成，进而诱导肝部肿瘤的发生；Koike等[8]研究发现DINP可加重NC/Nga小鼠过敏性皮炎模型的相关症状。氧化应激是许多疾病和毒理作用的重要发病和作用机制，可以引发肿瘤、畸形、衰老等多种后果。本课题组研究发现DINP能够在氧化应激作用下造成小鼠肝脏和肾脏的氧化损伤、DNA损伤和病理损伤[9]。肺脏是环境和工业污染物极易直接作用的重要靶器官，目前DINP对肺脏毒作用的研究报道较少，本研究通过测定不同剂量DINP作用下小鼠肺组织的活性氧(ROS)、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量以及DNA-蛋白质交联(DPC)系数的变化，并同时观察肺组织切片的生理病理变化，以探究其对小鼠肺组织的氧化损伤作用。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器与试剂

主要仪器：Power wave XS酶标仪(美国Bio-Tek仪器有限公司)，FLx 800荧光酶标仪(美国Bio-Tek仪器有限公司)，F-4500型荧光分光光度计(日本日立公司)，DP73光学显微镜(日本奥林巴斯公司)，5415R低温冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，RM2245切片机(德国LEICA公司)，HH-42三用电热恒温水箱(北京长源实验仪器厂)。

主要试剂：邻苯二甲酸二异壬酯(DINP，≥99.6%，Sigma公司)，二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA，>99.9%，Sigma公司)，蛋白酶K(Sigma公司)，Hoechst33258荧光染料(Sigma公司)，还原型谷胱甘肽试剂盒(南京建成生物工程研究所)，三羟基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCL，分析纯，Amresco分装)，5,5’-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，硫代巴比妥酸(TBA，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，十二烷基硫酸钠(SDS，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，其他使用试剂均为国产分析纯。

1.1.2 实验动物

选用湖北省实验动物研究中心提供的SPF级雄性昆明小鼠42只(合格证号：No.42000600001035)，体重为(24 ± 1.05) g，适应性驯养1周后实验。饲养过程中，每日定时定量给予商业用鼠粮，并及时补充饮用水。小鼠养于无菌无病原专用鼠笼内，可自由取食饮水。动物饲养室内温度控制在20～25 ℃，室内相对湿度为50%～70%，保持室内安静，避免强光照对小鼠影响。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组和染毒

42只昆明小鼠随机分为7组，包括1个阴性对照组、4个DINP染毒组，每组6只。阴性对照组用生理盐水；根据本课题组已有的研究[10]，将染毒组的染毒剂量确定为0.2、2、20、200 mg·kg-1，以生理盐水将储备液稀释成0.02、0.2、2和20 mg·mL-14种浓度的染毒液，在稀释过程中加与DINP等量的吐温80助溶；阴性对照组仅给予生理盐水；稀释液现用现配，使用前在旋涡混悬仪上充分混匀。均经口灌胃给予，灌胃量为10 mL·kg-1。阴性对照组、染毒组连续染毒14 d，分别于实验前称小鼠重量并记录。

1.2.2 肺组织切片的制备和观察

肺组织用4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡切片，H&E染色，普通光学显微镜下观察肺组织的病理组织学变化。

1.2.3 肺组织匀浆和悬液的制备

肺组织于冰冷PBS(pH=7.5)中漂洗，滤纸拭干，分成两部分，一部分肺组织加冰冷PBS重悬制成10%(10 mg·L-1)匀浆液，4 °C，9 300 × g离心10 min后取上清，用于ROS、GSH和MDA检测。另一部分肺组织在冰冷PBS中剪成≈1 mm3糜状组织块，4层擦镜纸过滤，滤液200×g离心5 min后离心取上清，再加冰冷PBS重悬细胞，用于DPC检测。

1.2.4 ROS含量的测定

取肺组织匀浆上清液4 μL，加入396 μL PBS作100倍稀释。取100 μL稀释液上样于酶标板中，加入100 μL荧光染料DCFA-DA，37 ℃黑暗环境中孵育5 min，使用荧光酶标仪在485 nm激发光、520 nm发射光条件下测定荧光强度值。

1.2.5 GSH含量和蛋白质含量的测定

GSH含量的测定严格按照试剂盒操作说明进行。GSH含量(μmol·g-1prot)=[(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)]×标准管浓度×样本稀释倍数÷待测匀浆蛋白浓度(g prot·L-1)。蛋白质含量按照Folin-酚法测定。

1.2.6 MDA含量的测定

取500 μL肺组织匀浆上清液于试管中，加入2 mL 0.6%TBA，沸水浴15 min。取上清1 mL于EP管中，10 000 ×g离心5 min。取上清100 μL上样于酶标板中，使用酶标仪分别在450 nm、532 nm和600 nm波长下测定吸光值(以PBS为对照)，按照公式计算MDA浓度(μmol·L-1)=6.45(A532-A600)-0.56A450(A为吸光度)，再根据样品中蛋白含量计算MDA含量：样品中MDA含量(μmol·g-1prot)=MDA浓度/样品中蛋白质含量。

1.2.7 DPC系数的测定

DPC采用KCl-SDS沉淀法进行检测[11]。首先向样品中加入SDS，使之与DPC及蛋白质结合，然后加入KCl溶液使DPC和蛋白质沉淀，而游离的DNA留在上清液中。将上清液转移后，再向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白质，使DPC中的DNA游离出来，用荧光法测定此DNA的含量A(交联DNA)以及原液中DNA的含量B(游离DNA)，计算DPC系数η[η= A/(A+B) ]。

图1 不同处理组肺组织切片图(10×40，H&E染色，n=6)Fig.1 Lung slices of different groups (10×40, H&E stains, n=6)

1.3 统计分析

采用SPSS 12.0统计分析软件进行统计分析，多组间均数比较使用单因素方差分析(ANOVA)，然后使用LSD检验比较两组间均数的差异性。统计检验水准ɑ = 0.05。

2 结果(Results)

2.1 小鼠肺组织形态的光镜观察结果

如图1所示：对照组切片中肺组织结构正常，肺泡腔结构完整、透亮，肺泡壁清晰可见，肺泡隔无血管充血扩张，肺组织内血管丰富。随着DINP染毒剂量增大，肺泡壁逐渐增厚，肺泡壁血管逐渐扩张充血，肺组织内血管扩张充血。0.2 mg·kg-1DINP组肺组织结构正常，肺泡腔结构完整，肺泡壁增宽，肺泡隔细胞增生。2 mg·kg-1DINP组肺组织结构正常，肺泡壁明显增宽，肺泡隔细胞增生，肺组织内血管扩张充血。20 mg·kg-1DINP组肺组织结构轮廓改变，肺泡壁增宽增厚，肺泡隔细胞增生明显，肺组织内血管扩张充血。200 mg·kg-1DINP组肺组织结构轮廓难辨认，肺泡腔大小不一，透亮区域减少，部分腔内可见粉染物质，肺泡壁弥漫性增宽，肺泡隔细胞大量增生，肺组织内血管扩张充血。

2.2 小鼠肺组织ROS含量的变化

表1可见不同处理组肺组织的ROS含量的变化，随着染毒剂量的升高，ROS含量逐渐上升，并呈一定的剂量-反应关系。与对照组比较，0.2、2 mg·kg-1DINP组差异无统计学意义，20、200 mg·kg-1DINP组差异有统计学意义(P< 0.05，P< 0.01)。

2.3 小鼠肺组织GSH含量的变化

GSH是GPx(谷胱甘肽过氧化物酶)催化过氧化物还原的必需底物，故GSH含量也可反映机体抗氧化应激的水平。不同处理组肺组织的GSH含量的变化见表1，随着DINP染毒剂量的升高，GSH含量逐渐下降，呈一定的剂量-反应关系。与对照组比较，0.2、2、20 mg·kg-1DINP组差异无统计学意义，200 mg·kg-1DINP组差异有统计学意义(P< 0.01)。

2.4 小鼠肺组织MDA含量的变化

不同剂量的DINP均能使小鼠肺组织MDA含量有不同程度的升高。与对照组比较，0.2、2 mg·kg-1DINP组差异无统计学意义，20、200 mg·kg-1DINP组差异有统计学意义(P< 0.01)，这表明小鼠肺组织的脂膜已受到损伤(表1)。

2.5 小鼠肺细胞DPC系数的变化

不同处理组肺细胞DPC系数的变化见表1。随着DINP染毒剂量的升高，DPC系数逐渐上升，呈一定的剂量-效应关系。与对照组比较，0.2、2、20 mg·kg-1DINP组差异无统计学意义，200 mg·kg-1DINP组差异有统计学意义(P< 0.01)。

3 讨论(Discussion)

肺脏是环境和工业污染物极易直接作用的重要靶器官，对内、外源化学物的代谢以及对外源化学物的防御都起着十分重要的作用。外源化学物可经2条途径到达肺脏：一是随吸入气体直接到达肺脏，另一条是由血液循环途径吸收，在肝脏内被相关酶类代谢而引起机体损伤[12]。DINP主要是经消化道吸收进入血液循环到达肺脏。本研究中病理学观察发现：随着DINP染毒剂量的升高，小鼠肺组织的病理损伤愈发严重。20、200 mg·kg-1DINP组肺组织结构轮廓改变，肺泡壁增宽增厚，肺泡隔细胞增生，肺组织内血管扩张充血。说明较高剂量DINP可对肺组织造成损伤，主要靶位点是肺实质部的肺泡和肺泡囊。肺泡是气体交换的主要功能单位，对肺泡细胞的损伤将直接影响肺功能。

表1 不同处理组小鼠肺的ROS、GSH、MDA含量和DPC系数

注：与对照组比较，* P < 0.05，**P < 0.01。

Note: * P < 0.05,**P < 0.01, compared with control group.

肺脏是直接暴露于高氧环境的唯一器官，肺泡水平的氧分压要明显高于其他脏器，因而在氧代谢过程中会产生大量ROS。部分外源毒物在肺内的反复氧化-还原也会产生大量ROS,一方面破坏肺脏的抗氧化保护机制，另一方面直接诱发肺的脂质过氧化作用，进而损伤肺细胞的结构和功能，总体效应是扩大炎症反应导致肺组织受损[13-14]。

生物体的正常代谢可以产生一定水平的ROS，正常低水平的ROS对维持机体正常生理水平有促进作用，包括参与机体能量代谢和物质代谢、参与机体免疫防御以及通过氧化还原修饰方式参与胞内信号转导[15]。ROS的过量会导致机体产生氧化应激作用，直接或间接作用于胞内脂类、蛋白质及DNA等生物大分子，诱导改变它们的结构和功能，导致细胞死亡甚至组织损伤，最终使机体出现病变症状[16]。肺脏在生理状态下可通过自身所具备的抗氧化酶和抗氧化物质消除肺脏毒物在肺中产生的ROS，谷胱甘肽(GSH)氧化还原循环在清除过氧化物时起着重要作用，还原型的GSH是ROS的主要清除剂，其可以和ROS结合形成硫代半缩醛，并生成具更强抗氧化作用的抗坏血酸，因而GSH的消耗可以反映机体的氧化损伤程度，在评价氧化损伤中具重要意义[17-18]。本研究中200 mg·kg-1DINP组小鼠肺组织ROS水平显著升高，GSH含量显著下降，说明高剂量DINP可以使机体过量产生活性氧，同时大量损耗GSH，使机体氧化/抗氧化之间平衡受到破坏。

过量的ROS可直接或间接进攻脂质分子引发脂质过氧化作用，使细胞膜流动性改变和脆性增加，使膜成分之间发生交联，增加细胞膜及膜性细胞器通透性，导致离子转运、能量代谢等细胞稳态功能紊乱[19]。MDA是脂质过氧化反应的主要代谢产物，其水平的高低代表脂质过氧化的强度和速率。本研究中20 mg·kg-1DINP组MDA含量显著上升，说明较高剂量DINP诱导小鼠肺细胞发生脂质过氧化，使细胞膜结构发生损伤。

DNA是ROS攻击的重要靶分子之一，损伤表现为DNA分子碱基修饰和链断裂两大类。DNA断裂可以与蛋白质结合形成DPC，DPC对DNA的构象和功能可以产生严重的影响，并易造成某些重要基因(如抑癌基因)的丢失，导致肿瘤或某些严重疾病的发生[20]。在本研究中，200 mg·kg-1DINP组DPC系数均显著上升，说明高剂量DINP可以引起小鼠肺组织DNA-蛋白质交联物形成，造成肺组织DNA损伤。

本研究结果表明，高剂量(≥200 mg·kg-1)DINP能引起小鼠肺组织的氧化损伤和病理损伤，氧化应激和氧化损伤可能是肺组织病理损伤的原因之一，造成损伤的机制还需进一步探讨。

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◆

Study on Oxidative Damage of Mouse Lung Cells Induced by Plasticizers Diisononyl Phthalate

Ma Ping1,2, Li Jinquan2, Yan Biao2, Liu Xudong2, Liao Wenli1, Yang Xu2, Wu Yang1,2,*

1. Lab of Environmental Biomedicine, School of Basic Medicine, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, China 2. Lab of Environmental Biomedicine, College of Life Science, Huazhong Normal University, Wuhan 430079, China

To evaluate oxidative damages of plasticizers diisononyl phthalate (DINP) on mouse lung tissue cell, Kunming mice were divided randomly into five groups and administered daily for two weeks. The groups included one saline group and four DINP groups (0.2, 2, 20 and 200 mg·kg-1). Lung tissue sections were isolated and stained for pathological observations under the microscope. Meanwhile, contents of reactive oxygen species (ROS), glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) in lung tissue homogenates, and DNA-protein crosslink (DPC) coefficients in the lung cell suspensions were measured. Results showed that lung tissue injury aggravated with the increase of DINP exposure concentration, with the contents of ROS, MDA and DPC coefficients increased in a dose-dependent manner, whereas GSH content decreased accordingly. In the 20 mg·kg-1exposure group, ROS and MDA contents were higher compared with the control group (P<0.05, P< 0.01). In the 200 mg·kg-1exposure group, there were significant differences in levels of each biomarker compared with the control group (P< 0.01). Data suggest that DINP at certain doses (≥20 mg·kg-1) can induce oxidative damage and pathological damages in mice lung tissue cell.

diisononyl phthalate; mice; reactive oxygen species; glutathione; malondialdehyde; DNA-protein crosslinks; oxidative damage

10.7524/AJE.1673-5897.20150824002

湖北省自然科学基金面上项目(2014CFB284)；国家自然青年科学基金项目(21507026)；湖北科技学院博士启动基金项目(BK1412)

马萍(1968- )，女，教授，研究方向为环境毒理学，Email: mping68@126.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: wysj2007@126.com

2015-08-24 录用日期：2015-10-23

1673-5897(2016)2-702-06

X171.5

A

简介：武阳(1983-)，男，博士，讲师，主要从事环境医学、细胞分子毒理学方面研究，已发表学术论文20余篇。

马萍, 李金泉, 晏彪, 等. 增塑剂邻苯二甲酸二异壬酯致小鼠肺细胞氧化损伤作用的研究[J]. 生态毒理学报，2016, 11(2): 702-707

Ma P, Li J Q, Yan B, et al. Study on oxidative damage of mouse lung cells induced by plasticizers diisononyl phthalate [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 702-707 (in Chinese)