用静电纺丝制备PCL/明胶新型组织工程支架用于人鼻中隔软骨修复研究

范洁　李岩　周苏波　徐宏宇

用静电纺丝制备PCL/明胶新型组织工程支架用于人鼻中隔软骨修复研究

范洁李岩周苏波徐宏宇

目的 用静电纺丝技术制备聚己内酯（PCL）/明胶生物活性支架，评价其相关理化性能及组织安全性，为今后静电纺丝生物活性支架进一步用于鼻中隔软骨组织工程修复提供研究基础。方法 运用静电纺丝制备PCL/明胶生物活性支架。扫描电子显微镜观察纤维膜表面形貌、接触角测量仪测定接触角、万能试验机测量纤维力学性能、与人鼻中隔软骨细胞共培养后MTT试验检测组织相容性。结果 所制备的PCL/明胶电纺支架表面光滑、分布均匀、直径范围200～1100nm，平均接触角（75.32±3.58）°，平均拉伸强度（4.21±0.38）Mpa，平均弹性模量（11.04±2.53）Mpa。MTT显示具有良好组织相容性。结论 作为一种新型支架材料，采用静电纺丝制备PCL/明胶电纺支架在组织工程领域有进一步的应用前景。

聚己内酯 静电纺丝 鼻中隔软骨细胞 组织工程支架

鼻中隔软骨主要为透明软骨，具有多向分化潜能与自我复制能力，可以同种异体移植并且易于获得使其成为良好的种子细胞。细胞外基质（ECM）复杂的网架结构，支持并连接组织结构，具有仿生结构制造的人工支架具有天然ECM的特点。通过静电纺丝技术制备的生物活性支架结构类似于天然ECM［1］。将天然高分子材料明胶加入至聚己内酯（PCL）溶液中，在满足其力学性能的同时，能够显著提高静电纺丝支架的生物安全性和组织亲合性［2］。本研究选择静电纺丝方法制备PCL/明胶生物活性支架，在此基础上检测纤维的微观形貌、接触角以及力学性能等理化性能，以及其对鼻中隔软骨细胞的组织安全性，为今后静电纺丝生物活性支架进一步用于鼻中隔软骨组织工程修复提供研究基础。

1　材料与方法

1.1材料 PCL（分子量8万，viscosity=0.81dl/g，济南岱罡生物工程有限公司）；二氯甲烷（AR，北京市通广精细化工公司）；N，N-二甲基甲酰胺（AR，国药集团试剂有限公司）。

1.2设备与仪器 TL-01型静电纺丝设备（深圳市通力微纳科技有限公司）。扫描电子显微镜（S-4800，Hitachi，日本）；DHG-9420电热真空干燥箱（上海海向仪器设备厂），EASY DROP K100型接触角测试仪（KRUSS，德国）。

1.3静电纺丝液的配制 根据以往文献回顾及之前的预实验，确定适宜的电纺溶液参数。观察组：PCL/明胶组。将PCL与明胶以1∶1的比例共同溶于二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）混合溶剂（v/v=8∶2）。配制成8% wt的静电纺丝溶液，磁力搅拌4h后超声脱气10min。对照组：PCL组，将PCL溶于二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺混合溶剂（v/v=8∶2）。配制成10% wt的静电纺丝溶液，磁力搅拌4h后超声脱气10min。

1.4生物活性支架的制备 将上述纺丝液分别加入10ml注射器，连接21G不锈钢喷头，设定喷头与接收板之间距离为15cm，以电压12kV，流速1.0ml/h为条件进行电纺。所制得的样品真空干燥24h排出残留有机溶剂。

1.5PCL/明胶生物活性支架的表征 将两组制备的电纺纤维样品喷金后使用扫描电镜（SEM）观察纤维形貌。测量电镜照片中的纤维直径，随机选取50根纤维计算平均直径和分布范围。

1.6接触角测量 将两组纤维膜分别剪成40 mm×10mm长条状，平整固定于载玻片上，使用接触角测试仪测量生物活性支架接触角，液体为甘油，在支架不同位置反复测量5次，取平均值［5］。

1.7电纺生物活性支架的力学性能 将厚度约为100 μm的电纺支架裁剪成最窄处10mm的哑铃形样条，在试验机上进行拉伸试验。计算得到各组纤维膜的拉伸强度、杨氏模量以及断裂伸长率的平均值。

1.8电纺生物活性支架的组织相容性 制备的两组电纺支架用专用打孔机裁剪成直径为12mm的圆形，Co60辐照消毒，平铺于24孔板底部，将鼻中隔软骨细胞消化后制成1×104/ml细胞悬液，每孔添加500μl。支架在5%CO2、37℃、100%湿度与细胞复合培养1、3、5、7d后分别向每孔中加入MTT溶液（5mg/ ml）50μl，37℃孵育4h，弃上清液。每孔加入500μl DMSO，摇床低速振荡10min。使用酶标仪测定490nm处的吸光值。所得OD值取平均值，细胞活力=观察组OD值/对照组OD值×100%［3］。

1.9统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1电纺支架的表征 扫描电子显微镜下观察到PCL/明胶电纺支架直径均匀，纤维方向随机分别并相互交错成网状，各组纤维表面光滑，无串珠及其他缺陷（见图1）。所测得纤维直径如图2所示。图中可见，PCL/明胶组纤维直径小于PCL组（P＜0.05），PCL纤维直径主要分布在200～1200nm之间，而PCL/明胶纤维直径主要分布在200～600nm之间，可知PCL纤维直径分布宽于PCL/明胶纤维。

图1　两组支架的SEM照片（左为观察组，右为对照组）

图2　相同参数下两组纤维直径

2.2电纺支架的接触角 用接触角测量仪所测得各组纤维接触角图片见图3，PCL/明胶组平均接触角（75.32±3.58）°，PCL组平均接触角（114.89±6.25）°，结果显示PCL/明胶组纤维的接触角显著小于PCL组（P＜0.05）。

2.3电纺支架的力学性能 两组纤维膜的力学性能见表1。

表1　两组纤维膜的力学性能（±s）

表1　两组纤维膜的力学性能（±s）

注：与PCL组比较，*P＜0.05

组别拉伸强度（MPa）弹性模量（MPa）断裂伸长率（%）PCL/明胶组4.21±0.38*11.04±2.53*40.14±2.69* PCL组6.69±0.5518.22±2.8630.17±1.13

2.4鼻中隔软骨细胞与电纺生物活性支架的组织相容性 鼻中隔软骨细胞在两组电纺纤维膜表面均可贴附牢固，生长状态良好。MTT检测中，鼻中隔软骨细胞与两组纤维膜共同培养1、3、5、7d后，如图4所示，各组吸光度均随时间增加而增大，各时间点吸光度差异均有统计学意义（P＜0.05）。而在每个时间点，PCL/明胶组吸光度均大于PCL组（P＜0.05）。

图3　两组支架的接触角（左为观察组 右为对照组）

图4　鼻中隔软骨细胞在两组支架上的增值情况

3　讨论

ECM调节细胞形态和功能如粘附、增殖和分化［4］。具有合适力学性能的3D结构生物活性支架最大限度模拟ECM。静电纺丝技术制备的纳米纤维支架有比表面积高、孔隙率大的特点，利于营养物质和代谢产物的输送［5］。众多学者成功运用静电纺丝技术制备出有生物活性的组成工程支架，并在体外进行细胞培养，均取得良好效果［6-7］。

PCL是一种人工合成半结晶性高分子，具有良好溶解性，能溶于各种有机溶剂中，并且具有易与其他高分子聚合物共混互溶等特性，使其成为常用的生物医用材料。胶原蛋白是天然高分子聚合物［8］，可以模仿与胶原联合应用，制备混合溶液进行电纺，既满足了支架的力学性能，又能提高支架的生物活性，利于种子细胞的生长。

本研究旨在制备PCL/明胶静电纺丝生物活性支架，电纺的过程以及支架的形态取决于多种因素的相互作用，包括所用溶剂的介电性能、液体的推注速度、电压、接收距离等。SEM照片可以直观观察支架的形貌及直径的变化，本实验中PCL/明胶组纤维的直径小于PCL组。同时，PCL/明胶组的直径分布比PCL组更宽。其可能的原因是由于明胶的引入，一定程度上改变电纺丝溶液的导电性和粘度，改善了电纺条件，使制备的支架纤维直径减小。而天然高分子材料的分子量差别较大，使电纺过程中溶液细流的鞭动不稳定，导致了部分纤维的溶并，使纤维直径的分布变宽。

接触角反映了纤维最初的亲水性。静电纺丝生物活性支架的亲水性能是影响支架与种子细胞间最初相互行为的关键因素，其能够直接影响到细胞的生存和繁殖能力。两组接触角不同的原因，是由于胶原的亲水性优于PCL，胶原与PCL的混纺支架凭借胶原的存在，使接触角小于PCL支架。

观察组PCL/胶原支架的力学强度与PCL组相比有一定降低，与此同时断裂伸长率由30%提升至40%。这可能是由于胶原的机械强度不如PCL，但特征粘度系数却比PCL高的原因。两组纤维均具有合适的力学性能，能满足组织工程的需要。PCL/明胶支架改善了PCL的拉伸性能，其性能处于软骨组织工程需要的范围内。良好的组织相容性是组织工程材料的基本要求［9］。本实验中鼻中隔软骨细胞与两组电纺支架复合培养3d后SEM观察显示，细胞呈多角形并向孔内生长。MTT结果显示，随着天然高分子材料明胶的加入，显著提高了PCL电纺支架与鼻中隔软骨细胞的亲合性，使细胞更易于附着和增殖。

综上所述，本实验成功制备了具有生物活性的PCL/明胶电纺支架，并验证了其与鼻中隔软骨细胞的组织相容性，为今后将其在组织工程中应用修复软骨缺损提供了研究基础。

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Objective To prepare a novel Polycaprolactone（PCL）/ Gelatin（GE）bioactive scaffolds by electrospinning，evaluate PCL/GE fi ber morphology；related properties and biocompatibility，we provided the basis for scaffold on tissue engineering. Methods By using the technology of electrospinning，bioactive scaffolds with PCL/GE. Then we observed the morphologyo，investigated hydrophilicity and measured the mechanical properties of the fi bers. And then human nasal septum cartilage cells were seeded on bioactive scaffolds to study their capacity to support stem cell attachment and proliferation by MTT. Results The bioactive scaffold fiber diameter was evenly distributed and the surface of fibers was smooth. The diameter，the hydrophilic absorption and the mechanical properties were different from scaffold with PCL. Conclusions The PCI/GE bioactive scaffolds can be prepared；at the same time the scaffolds indicate the well prospects on the fi eld of tissue engineering.

Polycaprolactone Electrospinning Nasal septum cartilage cell Tissue engineering scaffold

315040 中国人民解放军第113医院耳鼻喉科