低氧条件下载二甲基草酰甘氨酸电纺纤维促血管化及成骨性能研究*

李家颖 杨隆君 花艳丽 陈起新 孟庆琛 李斌，韩凤选

骨损伤是常见的外科疾病，较小的骨损伤可以自行愈合，而当骨缺损范围较大时常无法自愈。组织工程技术为骨修复提供了新途径，但骨修复材料移植后宿主血液难以渗透入支架，导致局部血供不足，故其修复效果较自体骨仍有差距。血管生成在骨发育和重建等过程中发挥着重要的作用[1-2]。因此，除骨组织工程支架材料的成骨性能外，其血管化也是促进骨缺损修复的重要因素。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可有效促进血管生成，同时，VEGF 也是参与骨修复过程的一种重要活性因子，其可通过影响血管内皮细胞和成骨细胞之间复杂的相互作用参与骨修复过程[3]。但是，VEGF 的有效活性和长效释放制约着其在组织工程中的应用。骨损伤后会导致损伤部位血供不足，从而在损伤部位形成低氧微环境[4]。损伤部位的低氧微环境可通过产生HIF-1上调组织中VEGF 的表达，促进VEGF 介导的血管化，而间接促进成骨[5-6]。低氧环境可降低胞内碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin，OCN）等成骨诱导因子的表达，而HIF-1 可在一定程度上促进低氧环境中细胞的成骨分化[7]。HIF-1 是持续表达的，但在常氧条件下会迅速降解，参与其降解过程的一种主要酶是脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylase domain，PHD）。有报道称，抑制PHD活性可提高内源性HIF-1 的表达水平[8]。目前，在众多PHD抑制剂中，二甲基草酰甘氨酸（dimethyloxallyl glycine，DMOG）具有良好的促血管生成性能和低生物毒性，因而可作为良好的血管化药物用于血管再生[9]。既往有研究表明，稳定HIF-1 的表达可高效促血管化[10]。而且相比于VEGF，DMOG 不易失活且成本较低，更具应用潜力。

静电纺丝技术是一种可制备具有微纳结构聚合物材料的技术，其在组织工程领域应用极其广泛。由静电纺丝技术制备的生物支架材料具有极高的比表面积及孔隙率，制备的纺丝纤维可通过负载不同的药物或者生长因子刺激胞外基质的分泌，从而利于细胞黏附、增殖及特异性分化[11]。

聚L-丙交酯-己内酯共聚物（PLCL）是一种可生物降解的高分子材料，具有良好的生物相容性及力学强度[12]，已被美国食品药品监督管理局（FDA）许可进入临床应用。因此，通过静电纺丝技术制备得到PLCL 电纺纤维（P），然后用其负载DMOG，通过电纺纤维持续低剂量控释DMOG，上调损伤部位HIF-1 表达，从而促进损伤部位血管化，进而实现骨修复。

此外，目前在组织工程中，体外评价细胞黏附、增殖和分化行为一般在常氧环境（20%）下进行，而正常骨组织的氧分压为5%～12.5%。因此，现有研究在评价材料的体外成骨性能时，将材料置于常氧环境下培养的方式忽视了体内骨缺损处低氧微环境的因素，其结果也有待通过体内试验验证。相较于常氧环境，低氧环境下干细胞的增殖会增强，干性更容易维持。所以为了更真实地反映所构建材料的体内成骨潜能，我们将负载DMOG 的电纺纤维（PD）在低氧的微环境下培养BMSC，通过体外实验考察其血管化及成骨分化潜能。

1 材料与方法

1.1 实验仪器及材料

PLCL（济南岱罡生物工程有限公司）；醋酸钙、磷酸二氢钠（国药集团化学试剂有限公司）；二甲基草酰甘氨酸（DMOG，赛业生物科技有限公司）；无水乙醇（永华化学科技有限公司）；-MEM 培养基、胎牛血清、胰酶和双抗（碧云天生物技术有限公司）；4%多聚甲醛通用型组织固定液（科赛恩生物技术有限公司）；TritonX-100（Sigma-Aldrich）；鬼笔环肽（上海翊圣生物科技有限公司）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，西格玛奥德里奇贸易有限公司）；OriCellSD 大鼠骨髓间质干细胞成骨诱导分化培养基试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；ALP 染色试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；扫描电子显微镜（CarlZeiss）；f1 倒置荧光显微镜（EVOS）。

1.2 负载DMOG 的PLCL 电纺纤维的制备

配制含DMOG 为3%（wt/v），PLCL 为12%（wt/v）的六氟异丙醇溶液，进行静电纺丝即可获得负载DMOG 的电纺纤维PD。以相同浓度的PLCL 溶液进行电纺即可制备电纺纤维P。电纺条件为：流速为1.2 mL/h，电压约10 kV，接收距离为10 cm。将制备的电纺纤维置于真空干燥箱中进行干燥，以去除残留的六氟异丙醇。

1.3 电纺纤维的形貌表征

经导电胶将电纺纤维固定于样品台上，喷金45 s 后通过扫描电子显微镜（SEM）观察电纺纤维的形貌。

1.4 细胞培养

将大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）种于灭菌的电纺纤维P 和PD 表面（分别记为P 组和PD 组），用含有10%血清及1%双抗的-MEM 培养基于37℃、5%CO2和常氧（20%O2）条件下进行培养。此外，以接种在细胞培养板上的细胞作为对照组，记为Control 组。细胞贴壁后，各取一半种有BMSC 的电纺纤维P 和PD 样品置于低氧细胞培养箱，在5%CO2和5%O2条件下中继续培养。

1.5 细胞形态观察

细胞在电纺纤维P 和PD 表面培养3 d 后，分别用鬼笔环肽（phalloidin）和DAPI 进行染色，然后于倒置荧光显微镜下观察细胞在电纺纤维表面的形貌。

1.6 成骨及血管化检测

将BMSC 种于细胞培养板中分别进行普通培养和成骨诱导培养，其中Control 组为普通培养组，以含10%血清及1%双抗的-MEM 培养基进行培养；Induction 组为成骨诱导培养组，以成骨诱导培养基进行培养。将BMSC 种于电纺纤维表面，分P 和PD 组，以成骨诱导培养基进行培养。分别于成骨诱导7 d和14 d后进行碱性磷酸酶染色及茜素红染色，并在不同时间点通过RT-PCR 测试成骨相关基因（ALP、Runx2、OCN、Col1）和血管生成相关基因（VEGF）的表达，评价不同电纺纤维的体外血管化及成骨性能。

2 结果

2.1 电纺纤维的形貌

通过静电纺丝技术，分别制备了电纺纤维P 和PD。SEM结果显示，P 为多孔网络结构，纤维表面光滑；而PD 的纤维直径有所增加，但依然具有良好的孔结构（见图1）。以上结果显示所制备的电纺纤维P 和PD 均呈现出纤维堆积结构并具有丰富的孔隙，从而有利于细胞黏附生长及营养物质交换。

2.2 细胞在电纺纤维上的生长

细胞在电纺纤维表面上培养3 d后的细胞骨架染色结果显示，常氧培养条件下，BMSC 可在电纺纤维P 表面黏附生长，且呈现一定的增殖趋势，表明电纺纤维P 具有良好的生物相容性。相比于电纺纤维P，BMSC 在电纺纤维PD 表面形态更加铺展，表明DMOG 的添加可提高电纺纤维P 的生物相容性，更利于细胞黏附和生长。在低氧培养条件下，随着培养时间的增加，许多BMSC 在电纺纤维P 表面的铺展受限，且细胞数量也不会随时间而逐渐增多。而DMOG的加入可明显促进BMSC 在电纺纤维PD 表面的黏附和生长，且细胞数量随培养时间增多，表明电纺纤维PD 在低氧条件下可维持细胞活性（见图2）。

2.3 体外成骨性能检测

将BMSC 种于电纺纤维表面，成骨诱导培养7 d 后进行碱性磷酸酶染色，结果发现，常氧培养条件下，电纺纤维PD可在一定程度上促进碱性磷酸酶的表达，而低氧培养条件下，电纺纤维PD 表面细胞内的碱性磷酸酶表达较弱（见图3A）。但是，成骨诱导培养14 d 后的茜素红染色结果显示，在常氧条件下，电纺纤维P 表面产生少量的钙结节，负载DMOG后，电纺纤维PD 表面钙沉积显著增多（见图3B）。而且，在低氧培养条件下，电纺纤维PD 表面的钙沉积量几乎可以覆盖整个支架表面，远多于电纺纤维P 表面的钙沉积量。

图1 A、B.电纺纤维P 的SEM 图；C、D.电纺纤维PD 的SEM 图

图2 常氧和低氧培养条件下，BMSC 在不同电纺纤维上的细胞骨架染色图

图3 常氧和低氧培养条件下，BMSC 在不同电纺纤维上的成骨分化情况：A.碱性磷酸酶染色；B.茜素红染色

成骨诱导培养7 d及14 d后对细胞的成骨相关基因表达量进行检测。结果发现，成骨诱导培养7 d 后，在常氧培养条件下，电纺纤维PD 表面生长的细胞具有显著的ALP 高表达趋势。而低氧培养条件下，电纺纤维P 可上调ALP 表达，负载DMOG 后的电纺纤维PD 可进一步促进ALP 的表达（见图4A）。常氧培养条件下，电纺纤维P 和PD 均可显著上调Runx2 的表达，而两者之间并无显著差异。与常氧培养条件相比，电纺纤维P 和PD 在低氧培养条件下均可上调ALP 及Runx2 的表达。其中，负载DMOG 的PD 组可进一步促进低氧环境中细胞内ALP和Runx2 的表达（见图4B）。

成骨诱导培养14 d 后，在常氧培养条件下，电纺纤维P 可显著上调Col1，加载DMOG 后，电纺纤维PD 可显著上调Col1 的表达；在低氧培养条件下，电纺纤维PD 可上调Col1 的表达（见图5A）。与Col1 表达不同的是，在常氧培养条件下，电纺纤维P 可显著上调OCN 的表达，而DMOG的加入可进一步促进OCN 的表达；在低氧培养条件下，电纺纤维P 和PD 可显著上调OCN 的表达，而DMOG 的加入并未显著促进OCN 的表达（见图5B）。

2.4 体外血管生成性能检测

笔者进一步对电纺纤维的体外促血管化性能进行检测，结果发现，常氧培养7 d 后，电纺纤维P 可促进细胞内VEGF表达，负载DMOG 的电纺纤维PD 可进一步促进细胞内VEGF 表达。低氧培养7 d 后，电纺纤维P 与电纺纤维PD的促VEGF 表达能力比较，差异无统计学意义（见图6A）。常氧培养14 d 后，电纺纤维PD 仍然具有显著的促VEGF 表达能力，而电纺纤维P 的促血管化能力下降。而低氧培养14 d 后，相对于电纺纤维P，电纺纤维PD 具有较强的促VEGF 表达能力，可显著促血管化（见图6B）。

图4 BMSC 在不同电纺纤维和氧含量培养条件下体外成骨诱导培养7 d 后成骨相关基因的表达情况。A.ALP；B.Runx2

图5 BMSC 在不同电纺纤维和氧含量培养条件下体外成骨诱导培养14 d 后成骨相关基因的表达情况。A.Col1；B.OCN

图6 BMSC 在不同电纺纤维和氧含量培养条件下体外成骨诱导培养7 d 和14 d 后血管相关基因VEGF 的表达情况。A.7 d；B.14 d

3 讨论

骨损伤后，损伤部位因为缺乏血供而形成低氧微环境，通过上调缺氧组织中VEGF 的表达可促进血管化，从而利于骨损伤修复。因此，如何通过促进血管化实现骨再生是一个重要挑战。

本研究通过静电纺丝技术制备得到PLCL 电纺纤维，用其负载DMOG 持续控释药物，以期通过促血管化实现促成骨。结果表明，本研究制备的电纺纤维具有良好的孔隙结构。将BMSC 种于材料表面后，细胞可在电纺纤维P 和PD表面铺展良好，展现出良好的生物相容性。尤其是在低氧培养条件下，细胞仍然可在电纺纤维PD 表面铺展良好，表明DMOG 的加入可显著促进细胞黏附生长。进一步对种植在不同纤维上的BMSC 进行低氧和常氧条件的成骨诱导，结果发现常氧培养条件下，与电纺纤维P 相比，负载DMOG的电纺纤维PD 可显著促进成骨相关基因ALP、Runx2、Col1及OCN 的表达。不仅如此，在低氧培养条件下，电纺纤维PD 仍可维持上述成骨相关基因的高表达，并通过茜素红染色表明其可产生更多的钙沉积，表明PD 展现出良好的体外成骨性能。此外，负载DMOG 后的电纺纤维PD 也能促进血管化相关基因VEGF 的表达，有效促进血管化。以上结果表明，负载DMOG 的电纺纤维有利于在骨损伤的低氧环境中促进成骨和血管，从而具有更好的骨修复潜能。综上所述，通过电纺纤维持续释放DMOG，可在体外低氧环境下促进血管化和干细胞的体外成骨分化，该生物支架材料具有良好的生物相容性及体外成骨性能，可作为优异的骨修复材料用于骨组织工程。

本研究制备的负载DMOG 的PLCL 电纺纤维能在低氧条件下支持BMSC 的黏附生长，与未负载DMOG 的电纺纤维相比能更好地促进BMSC 的血管化及成骨分化，预期将能更好地在骨损伤低氧微环境中发挥促成骨作用。