白藜芦醇对辐射诱导调节T细胞紊乱的调节作用

王 辉 张 恒 王 浩 阎 皓

白藜芦醇对辐射诱导调节T细胞紊乱的调节作用

王 辉1张 恒1王 浩2阎 皓1

目的观察电离辐射及白藜芦醇对调节T细胞的影响，探讨其对细胞因子TGF-β及IFN-γ的影响，阐明白藜芦醇对辐射诱导免疫抑制的改善作用。方法将24只C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组、照射组和照射给药组，每组8只。照射组和照射给药组接受137Cs源γ射线全身照射（6.0 Gy），对照组小鼠接受伪照射。照射前7 d及照射后28 d，每日予白藜芦醇（20 mg/kg）灌胃。末次给药后1 d，检测各组小鼠外周血CD4+CD25+细胞数量，CD4+CD25+细胞内FoxP3表达水平，脾淋巴细胞TGF-β分泌水平，以及CD8+细胞及脾淋巴细胞TNF-γ表达水平。采用单因素方差分析对3组间的细胞比例及细胞因子表达水平进行比较，组间多重比较采用LSD-t检验。结果与正常小鼠比较，电离辐射可以增高CD4+CD25+细胞在外周血单核细胞和CD4+中的比例125.0%和57.2%，增高脾细胞TGF-β水平31.4%，降低脾细胞IFN-γ表达水平26.9%，组间差异均具有统计学意义（均P＜0.05）；白藜芦醇干预可以降低单纯照射组小鼠调节T细胞在外周血单核细胞和CD4+中的比例32.3%和27.8%，降低CD4+CD25+细胞的FoxP3阳性比例26.6%，以及脾淋巴细胞TGF-β水平62.9%，增加CD8+T细胞及脾淋巴细胞生成的IFN-γ水平133.0%和87.4%，组间差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。结论白藜芦醇可以抑制调节T细胞，改善受照小鼠的免疫功能。

白藜芦醇；调节T细胞；TGF-β；IFN-γ；电离辐射

Int J Med Radiol，2016，39（6）：603-606

放疗是恶性肿瘤重要的治疗手段，尤其对于部分病人是唯一的治疗手段[1]。相关研究表明放疗期间病人可出现免疫功能下降，对病人预后造成不良影响[2]，因此对其机制及改善手段的研究具有重要的理论和临床价值。恶性肿瘤具有多种免疫逃避机制，包括分泌多种免疫抑制因子、介导细胞表面FasL表达、诱导具有免疫抑制作用的调节T细胞增殖和分化[2-3]等。有研究[4]表明，肿瘤进展期间常伴随调节T细胞增殖，并可能通过TGF-β通路介导。

白藜芦醇富含于虎杖、葡萄等植物体内，是一种非黄酮多酚类化合物，对人类免疫缺陷病毒（HIV-1）、单纯疱疹病毒等多种病毒具有抑制作用，对于幽门螺旋杆菌等具有抗菌作用[5]。低剂量的白藜芦醇可以增加小鼠Th1细胞相关细胞因子，如白细胞介素-12（IL-12）和干扰素-γ（IFN-γ），可以促进淋巴细胞增殖及IL-2水平，进而增强小鼠免疫力[6]。相关研究表明，白藜芦醇对多种实体瘤，如胃癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等具有抑制作用，并可能与免疫调节作用相关[6]。以上免疫调节作用及抗肿瘤作用，均与调节T细胞功能相关，本研究对受照小鼠用白藜芦醇干预，研究电离辐射及白藜芦醇对调节T细胞的影响，并探讨其对免疫抑制细胞因子（转化生长因子-β，TGF-β）及CD8+生成的IFN-γ的影响，阐明白藜芦醇对辐射诱导免疫抑制的改善作用。

1 材料与方法

1.1 一般材料①实验动物。C57BL/6雄性小鼠(SPF级)24只，8周龄，体质量20～22 g，购自中国医学科学院动物研究所，合格证号[SCXK(京)2005-0013]，实验动物的使用经天津市人民医院实验动物管理委员会批准。小鼠每笼4只饲养于SPF级动物房（饲养设施合格证号：SVXK津2009-0002）。②主要仪器和试剂。照射源为137Cs伽马射线辐照仪（加拿大Atomic Energy公司）；LSRII流式细胞计数仪（美国BD Bioscience公司），Flowjo7.6.2版流式细胞分析软件（美国FlowJo公司）；白藜芦醇购自美国Sigma公司；BD Pharm LyseTM裂解液购自美国BD公司；FoxP3染色缓冲液（美国eBioscience公司，Cat. No.005523）；布雷菲德菌素A（美国Sigma公司）；CD16/32mAb（2.4G2，美国BD Pharmingen公司)；anti-CD4 PE-CY5抗体，anti-CD8 FITC（53-6.7），anti-CD25 PE抗体，FITC anti-mouse FoxP3抗体（FJK-16），anti-IFN-γ PE抗体（XMG1.2）均购自美国eBioscience公司；酶联免疫吸附试剂盒购自美国R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理24只小鼠按体质量随机分为正常对照组、单纯照射组和照射给药组。每组8只，对照组给予假照射（即不照射），单纯照射组和照射给药组小鼠进行腹部137Cs伽马射线照射，吸收剂量6.0 Gy，源靶距40 cm，吸收剂量率0.73 Gy/min。白藜芦醇用0.5%的羧甲基纤维素钠溶液助溶配制成悬浊液，照射前7 d至照射后28 d每天灌胃给药（20 mg/kg）。对照组和单纯照射组小鼠按照射给药组方法给予同等量载体灌胃。用药剂量和给药方式根据相关前期工作和预实验制定[7]。

1.2.2 免疫细胞准备小鼠照射后第29天，从眼静脉丛取血，EDTAK3抗凝，用BD Pharm LyseTM裂解液在4℃裂解5 min，制备的外周血单核细胞（PBMC）用含1%小牛血清的磷酸盐溶液（PBSBSA，pH7.4）洗2次，在RPMI 1640液中再悬浮备用。小鼠脱颈处死后收获脾，研磨后用400目的不锈钢网制备单细胞悬液，淋巴细胞用Hank’s平衡盐液（HBSS）清洗后，裂解红细胞方法同上，在RPMI 1640液中再悬浮备用。

1.2.3 流式细胞计数仪分析PBMC悬液在CD16/ 32mAb中孵育阻断FcRs非特异染色，加入适当浓度anti-CD4 PE-CY5抗体、anti-CD25 PE抗体，在4℃暗光孵育30 min。细胞洗3次后在流式细胞分析(FCM)缓冲液（磷酸盐缓冲液加0.1%小牛血清加0.1%NaN3）中悬浮。细胞清洗3次后用LSRII流式细胞计数仪分析，每样本至少分析5 000个细胞，随后进行数据分析。

1.2.4 细胞内FoxP3和IFN-γ染色为检测PBMC内FoxP3表达，细胞用anti-CD4 PE-CY5抗体、anti-CD25 PE抗体孵育，清洗后按说明书操作步骤用

FoxP3染色缓冲液固定和通透，用FITC anti-mouse FoxP3抗体（FJK-16）于4℃暗光孵育30 min。为检测CD8+T细胞核内IFN-γ表达，蛋白转运抑制剂布雷菲德菌素A加入细胞培养液孵育5 h以累积细胞内细胞因子。加入Fc阻断剂在4℃孵育5 min，加入anti-CD8 FITC抗体暗光孵育30 min。染色后，细胞送LSRII流式细胞计数仪分析，每样本至少分析5 000个细胞，随后进行数据分析。

1.2.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测IFN-γ、TGF-β脾淋巴细胞用含200 μg/mL小牛血清的PRMI培养液调为1×107个细胞/mL孵育24 h，按说明书步骤用酶联免疫试剂盒检测上清液IFN-γ含量；按说明书步骤通过酸化将无活性的Lat-TGF-β活化，用酶联免疫试剂盒检测上清液活化TGF-β含量。

1.3 统计学方法采用SPSS16.0软件包分析数据。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况对照组小鼠皮毛光滑，身体健壮，饮食、活动正常，体质量增长，实验结束时无死亡。照射组小鼠皮毛干枯无光泽，精神弱，反应迟钝，进食不积极，呼吸急促，体质量无增长，无死亡。照射给药组与照射组比较，小鼠皮毛光泽尚可，身体较壮，饮食、活动积极，体质量有增长，无死亡。

2.2 白藜芦醇对CD4+CD25+细胞数量的影响正常对照小鼠的CD4+CD25+细胞数量处于较低水平，电离辐射可以导致CD4+CD25+细胞在PBMC中的比例升高125.0%，在CD4+细胞中的比例升高57.2%；照射给药组与单纯照射组比较，CD4+CD25+细胞在PBMC中的比例降低32.3%，在CD4+T细胞中的比例降低27.8%，各组间差异均具有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

2.3 白藜芦醇对CD4+CD25+细胞的FoxP3阳性比例的影响电离辐射对CD4+CD25+细胞的FoxP3阳性比例没有显著影响，照射给药组较照射组小鼠CD4+CD25+细胞的FoxP3阳性比例降低26.6%，两组间差异具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.4 白藜芦醇对脾淋巴细胞TGF-β水平的影响照射组较正常对照组TGF-β水平增高31.4%；照射给药组较照射组小鼠TGF-β水平降低62.9%，组间差异均具有统计学意义（均P＜0.05）（表1）。

2.5 白藜芦醇对IFN-γ水平的影响照射组脾细胞IFN-γ表达水平为703.2pg/mL，较对照组降低26.9%（P＜0.05），照射给药组CD8+T细胞中IFN-γ阳性比例为2.113%，较单纯照射组提高133.0%；照射给药组脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平较照射组增高87.4%，达到1 317.8 pg/mL，组间差异均具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

3 讨论

在肿瘤发生发展中，调节T细胞诱导的免疫抑制起到重要作用，在肿瘤的放化疗中，调节T细胞也对预后起到不良作用。相关研究表明电离辐射可以短期诱导调节T细胞比例增高，并可能抑制细胞免疫和体液免疫，但尚无有效的防护措施[8]。本研究表明，小鼠接受亚致死剂量（6 Gy）的γ射线全身照射，可以导致长期调节T细胞比例增高，而白藜芦醇连续干预可以有效降低受照小鼠调节T细胞比例，提示白藜芦醇可以改善受照小鼠由调节T细胞诱导的免疫抑制。

表1 各组间细胞比例及细胞因子表达水平比较（n=8,x±s）

以往研究中，调节T细胞定义为细胞膜表面表达CD4和CD25蛋白，调节T细胞多数表达叉头状家族转录蛋白FoxP3，对调节T细胞的发育和功能起到重要作用[9]。FoxP3作为调节T细胞重要的胞内标志，并与细胞膜表面蛋白CD4和CD25共同用于调节T细胞的定义。Chen等[4]的研究表明，小鼠CD4+ CD25+细胞内表达FoxP3的比例为72%～79%，对抑制细胞免疫起到重要作用。本研究中这一比例为

76.32%，与上述研究结果基本相符，如表1所示，电离辐射对CD4+CD25+细胞FoxP3阳性比例有增加趋势，而长期低剂量白藜芦醇干预可以有效降低CD4+CD25+表达FoxP3，改善受照小鼠免疫功能。

TGF-β是具有免疫抑制作用的细胞因子，对癌细胞的生长起重要作用，TGF-β可以诱导CD4+ CD25+增生[10-11]，可以协同刺激FoxP3表达，进而将外周血CD4+CD25-细胞分化为CD4+CD25+调节T细胞[12]，而调节T细胞可以通过TGF-β通路抑制CD8+T细胞介导的肿瘤细胞特异细胞毒作用[4]。本研究结果显示，电离辐射可以诱导TGF-β分泌；白藜芦醇干预可以有效降低受照小鼠TGF-β水平，提示白藜芦醇可以有效改善辐射诱导的免疫功能抑制。本研究中TGF-β分泌水平下降伴随FoxP3表达水平降低，与Islas-Vazquez等[11]的研究结论相符。白藜芦醇对肿瘤免疫作用的调节机制尚未明确，是否通过抑制TGF-β抑制FoxP3表达进而抑制调节T细胞生成和功能，尚有待进一步研究。

IFN-γ具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤作用，可被调节T细胞及TGF-β信号通路抑制，抑制调节T细胞、刺激CD8+T细胞可以促进IFN-γ生成[13]。本研究表明，白藜芦醇可以有效增加CD8+T细胞IFN-γ阳性比例及脾淋巴细胞生成IFN-γ水平，提示白藜芦醇可以作为免疫刺激剂对机体免疫起到积极作用。本研究结果表明IFN-γ水平升高与调节T细胞数量及TGF-β水平呈负相关，这与Luz-Crawford等[13]的研究结果相符。但白藜芦醇对IFN-γ调节的作用机制尚不明确，是否与抑制调节T细胞及降低TGF-β表达水平相关尚需进一步研究。

总之，电离辐射可以增加调节T细胞比例，增高脾淋巴细胞TGF-β水平；白藜芦醇可以降低调节T细胞比例，降低脾淋巴细胞TGF-β水平，增加CD8+T细胞生成的IFN-γ水平，其调节机制需要进一步研究阐明。

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（收稿2016－08－17）

Regulatory effect of resveratrol on radiation induced regulatory T cell disorder

WANG Hui1,ZHANG Heng1,WANG Hao2,YAN Hao1.
1 Department of Oncology,Tianjin Union Medical Center,Tianjin 300121,China;2 Department of Pharmaceutical,Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences

ObjectiveTo observe the effects of ionizing radiation and resveratrol on the regulatory T cells and to investigate the effects of resveratrol on TGF-β from spleen cells and IFN-γ from CD8+T cells and splenic lymphocytes.To elucidate the effect of resveratrol on radiation induced immunosuppression.MethodsTwenty-four C57BL/6 male mice were randomly divided into control group,irradiation group,and irradiation+resveratrol group.Irradiation group and irradiation+ resveratrol group received total body irradiation（γ-ray,6.0 Gy）,while the control group received pseudo-irradiation. Resveratrol（20 mg/kg）was orally administered to the mice 7 days before and 28 days after irradiation.One day after the last administration,the number of CD4+CD25+cells in peripheral blood of mice was detected.The expression of FoxP3 in CD4+ CD25+cells was detected.The level of TGF-β in splenic lymphocytes and the expression of TNF-γ in CD8+cells and splenic lymphocytes were detected.The cell ratio and the expression of cytokines were compared by single factor analysis of variance（ANOVA）.Multiple comparisons between groups were performed by LSD-t test.ResultsCompared with control mice,irradiation increased the percentage of CD4+CD25+cells in peripheral blood mononuclear cells and CD4+cells by 125.0%and 57.2%,increased the level of TGF-β in spleen cells by 31.4%,and decreased the level of IFN-γ expression in spleen cells by 26.9%.The differences between groups were statistically significant（all P＜0.05）.Treatment of resveratrol could decrease the ratio of regulatory T cells in peripheral blood mononuclear cells and CD4+cells of irradiated mice by 32.3%and 27.8%,decrease the level of TGF-β in splenic lymphocytes by 62.9%,respectively,increase the level of IFN-γ in the CD8+T cells and spleen lymphocytes by 133.0%and 87.4%,respectively.The differences between groups were

Resveratrol;Regulatory T cells;TGF-β;IFN-γ;Ionizing radiation

10.19300/j.2016.L4641

R815

A

1天津市人民医院肿瘤科，天津300121；2中国医学科学院放射医学研究所辐射防护与药物研究室

王辉，E-mail：ezxwanghui@sohu.com

国家自然科学基金面上项目（81573089），天津市卫计委科技基金（2015KZ061）

statistically significant（all P＜0.05）.ConclusionResveratrol can inhibit the regulatory T cells and improve the immune function of irradiated mice.