口腔癌患者应用二甲双胍对KB细胞增殖及凋亡的影响

仲晓飞 杜原宏 马 铁



口腔癌患者应用二甲双胍对KB细胞增殖及凋亡的影响

仲晓飞 杜原宏 马 铁

目的 研究口腔癌患者应用二甲双胍进行治疗，观察其对KB细胞的增殖以及凋亡的影响。方法 收集生化药理研究室的人口腔癌KB细胞，采用随机数字表法将人口腔癌KB细胞分别采用不同浓度的二甲双胍进行处理，并观察24 h、48 h、72 h细胞增殖的情况，采用碘化丙啶(PI)染色进行检测KB细胞的凋亡情况，采取Western blot方法分别处理不同的时间进行检测GRP78和Caspase-3蛋白的表达。结果 经过浓度为5 mol的二甲双胍进行处理的KB细胞24 h、48 h、72 h细胞存活率之间进行比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；采用浓度分别为2.5 mol与 5 mol的二甲双胍处理，细胞的凋亡率分别为12.13%、25.12%,组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05)；采用浓度为5 mol的二甲双胍处理不同的时间，可观察到GRP78的表达被诱导且Caspase-3蛋白被激活。结论 二甲双胍作为新型的抗癌症辅助药物，具有良好的抑制人口腔癌KB细胞的增殖、并诱导其凋亡的作用，为临床治疗口腔癌提供了新的治疗途径。

口腔癌；二甲双胍；KB细胞；增殖；凋亡

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1782～1784)

口腔癌是人体头颈部较好发的肿瘤之一，这也是一个由多种因素参与并产生的，其中最常见的因素有病毒的感染以及不良的饮食方式等，尤其是吸烟与饮酒的危险因素最大[1-2]。目前在临床上大多采取手术进行口腔癌治疗，但是由于早期症状不明显，容易被忽视，因此大部分患者确诊时处于中晚期，这不仅给治疗带来了一定的难度，也对患者造成了极大的痛苦[3-4]。部分患者联合放化疗进行治疗，但由于个体的差异有些患者会产生药物的耐药性，而大大降低治疗效果[5]。近年来二甲双胍逐渐被应用于临床治疗口腔癌，并具有一定的效果。本文旨在研究口腔癌患者应用二甲双胍进行治疗，观察KB细胞的增殖以及凋亡的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究材料

收集我院从2013年7月至2014年8月生化药理研究室的人口腔癌KB细胞采用随机数字表法进行研究。其中生物与化学试剂包括有：MEM培养基；二甲双胍；胰蛋白酶；胎牛血清；兔抗人Caspase-3抗体；兔抗人GRP78抗体；鼠抗人β-actin等。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞增殖与存活率的计算 在含有10%胎牛血清的新鲜MEM培养液中将KB细胞进行接种培养，培养温度为37 ℃，培养箱中置有5%的CO2。采用MTT法检测细胞的生长情况，分别加入二甲双胍药物浓度为1.25 mmol/L，2.5 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L，20 mmol/L的新鲜培养液中分别培养24 h，48 h，72 h，重复进行3次试验后计算细胞的存活率。

1.2.2 细胞凋亡的检测 采用碘化丙啶染色的方法检测细胞的凋亡情况。将KB细胞制成单细胞悬液进行接种，分别加入浓度为2.5 mmol/L与5 mmol/L的培养液观察24 h后进行离心10 min,频率为1 500 r/min，将上清液弃去，在4 ℃的环境中加入75%乙醇进行固定一晚，第2天将固定液置于5 ml的EP管中，进行再一次的频率为1 000 r/min的离心，时间为10 min，再次将上清液弃去，并进行碘化丙啶染色，静置2 h并避光后进行流式细胞仪检测细胞的凋亡率。

1.2.3 GRP78与Caspase-3的表达 采用浓度为5 mol的二甲双胍处理不同的时间，观察GRP78与Caspase-3的表达情况，取成对数生长期的KB细胞接种于细胞培养板中进行培养，并加入浓度为5 mol的二甲双胍。

1.3 观察指标

观察二甲双胍对人口腔癌KB细胞的增殖抑制作用以及凋亡作用。

1.4 统计学方法

将所得数据采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，定性资料采用独立样本R×C列联表资料的χ2检验。按照α=0.05的检验水准，以P<0.05为标准进行参照差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 二甲双胍处理口腔癌KB细胞的增殖抑制作用

经过浓度为5 mol的二甲双胍进行处理的KB细胞24 h、48 h、72 h细胞存活率分别为67.50%、37.20%、15.61%，处理48 h、72 h的KB细胞存活率与24 h的比较，差异均有统计学意义(χ2=18.403、55.433，P均<0.05)。

2.2 二甲双胍处理口腔癌KB细胞的凋亡作用

采用浓度分别为2.5 mol与 5 mol的二甲双胍处理，细胞的凋亡率分别为12.13%、25.12%,组间比较差异均具有统计学意义(χ2=5.567，P<0.05)。

2.3 二甲双胍处理口腔癌KB细胞对 GRP78 与Caspase-3的表达所产生的影响作用

采用浓度为5 mol的二甲双胍处理不同的时间，可观察到GRP78的表达被诱导且Caspase-3蛋白被激活。见图1。

图1 经二甲双胍处理口腔癌KB细胞后GRP78与Caspase-3的表达

2.4 二甲双胍对于KB细胞集落克隆的抑制作用

随着二甲双胍浓度的增高，口腔癌细胞增殖抑制作用对于集落克隆染色检测越强。图2分别表示0 mmol/L，0.25 mmol/L，0.5 mmol/L，1 mmol/L浓度的二甲双胍。

2.5 人口腔癌KB细胞线粒体膜电位采用二甲双胍进行线粒体膜电位检测试剂盒的检测结果

经过24 h的处理后，与阴性对照组进行比较，荧光的转变由红色向绿色，这表示口腔癌KB细胞线粒体膜电位下降，细胞发生凋亡。

3 讨论

在全世界范围中口腔癌是常见的六大肿瘤，美国疾控中心在2010年统计到全球患有口腔癌的患者大约有50万人，且死亡率极高[6-7]。处于中晚期的口腔癌患者大多采取手术联合放化疗的方式进行治疗，虽然治疗效果较好，但患者的5年生存率较低[8]。由于口腔的解剖位置较为表浅，大多是由于癌前病变所引起，包括人们的不良生活方式比如吸烟以及饮酒以及食用刺激性较大的实物所导致。口腔癌的患者的口腔功能常常遭到严重的损害，对于患者的饮食、语言交流以及社会交往均带来了一定的不便[9]。处于早期口腔癌的患者对于其局部功能以及外观的影响较小，因此早期发现并进行治疗在临床上具有一定的积极意义。

二甲双胍是临床上广泛使用的一种降糖药物，但其除了降血糖的药理作用之外，还可用于抗肿瘤，能够有效抑制肿瘤的生长并促进肿瘤细胞的凋亡，具有解除肿瘤的耐药性以及抗肿瘤血管生成的作用[10-11]。

本研究经过对人口腔癌KB细胞的培养与研究为临床治疗口腔癌提供了新的治疗途径，即找到了肿瘤细胞新的敏感靶点而达到提高治疗效果的目的。内质网应激反应中最具有代表性的应激蛋白之一是GRP78，在应激状态下如低氧、低糖、低钙等情况下表达将会增加[12-13]，其恢复细胞功能与保护内质网应激所引起的细胞损伤的机制是通过激活未折叠蛋白来参加反应[14]。内质网功能的中心调节者是内质网分子伴侣GRP78，其在细胞中发挥着极其重要的作用，比如促进非折叠蛋白质的降解并帮助蛋白质的折叠与聚集以及控制激活内质网的跨膜感受器等方面，UPR的启动以及内质网的应激反应均需要生物标记GRP78来诱导；在没有内质网应激的状态下GRP78分别结合内质网上的应激感受蛋白IREla，ATF6，PERK，且处于无活性的状态。有研究结果表明[15]，当细胞中的钙离子缺乏营养与缺氧而处于平衡失调的状态激活未折叠的蛋白而发生反应时通过起始的3条信号通路IRE1，PERK，ATF6，可以使多基因转录并激活，选择性的翻译具有特性的蛋白质，从而蛋白质的翻译与折叠得以正确进行而来促进内质网应激反应的适应。当细胞中的钙离子缺乏营养与缺氧而处于平衡失调的状态下，此时的未折叠的蛋白堆积触发内质网处于应激状态，造成GRP78与应激感受蛋白处于分离状态，所以口腔癌细胞对内质网应激途径化疗耐受的原因之一是GRP78的高表达。

图2 不同浓度二甲双胍对KB细胞集落克隆的抑制作用

综上所述，二甲双胍具有抑制人口腔癌KB细胞的增殖、并诱导其凋亡的作用，作为一种新型的抗癌症辅助药物，这为临床治疗口腔癌提供了新的治疗途径，但由于本研究的局限性，二甲双胍抗肿瘤的用药浓度以及给药途经对患者所造成的耐受性还需进一步进行探讨。

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(编辑：甘 艳)

Effect of Metformin on the Proliferation and Apoptosis of KB Cells in Patients with Oral Cancer

ZHONGXiaofei,DUYuanhong,MATie.

463HospitalofPLA,Shenyang,110042

Objective To study the effect of metformin on the proliferation and apoptosis of KB cells in oral cancer patients.Methods KB cells were treated with different concentrations of metformin,and cell proliferation at 24 h,48 h,72 h were observed.The apoptosis of KB cells was detected by PI staining.The expression of GRP78 and Caspase-3 protein were detected by blot Western method.Results The survival rates of KB cells at 24 h,48 h,72 h treated by 5mol metformin had statistically significant difference(P<0.05).The apoptosis rate of KB cells treated by 2.5 mol and 5 mol metformin were 2.13% and 25.12%,respectively,there had statistically significant difference (P<0.05).The expression of GRP78 was induced and Caspase-3 was activated when treated by 5 mol metformin.Conclusion Metformin as a new type of anticancer drugs has a good effect in inhibiting proliferation and inducing apoptosis of KB cells,which provides a new way for clinical treatment of oral cancer.

Oral cancer;Metformin;KB cells;Proliferation;Apoptosis

110042 解放军第四六三医院

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.11.012

R739.85

A

1001-5930(2016)11-1782-03

2015-12-08

2016-04-05)