氯化镉诱导骨肉瘤细胞凋亡的效应及其分子机制

叶 彬 陈令斌 刘 融



氯化镉诱导骨肉瘤细胞凋亡的效应及其分子机制

叶 彬 陈令斌 刘 融

目的 通过观察氯化镉诱导的骨肉瘤细胞凋亡与细胞特异性周期阻滞及caspase活化的影响，阐明氯化镉诱导的细胞凋亡效应及其分子机制。方法 应用AnnexinV/PI和API等标记，流式细胞仪对人骨肿瘤细胞凋亡及周期特异性的检测，运用RT-PCR的方法检查Caspase-3、Caspase-9活化情况。结果 处于静止期的外周血对氯化镉凋亡诱导不敏感，而G1期氯化镉诱导骨肉瘤细胞出现了明显的细胞凋亡。氯化镉诱导的细胞凋亡主要是在细胞周期的G1期发生。观察组采用氯化镉凋亡诱导，对照组未做处理，结果显示观察组的Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表达值显著高于对照组。结论 氯化镉诱导的细胞凋亡与骨肉瘤细胞的细胞周期相关，存在G1期细胞周期阻滞的周期特异性，且此过程中发生了caspase活化，参与细胞凋亡。

氯化镉；骨肉瘤细胞；细胞凋亡；细胞周期

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1759～1762)

骨肉瘤是儿童、青少年最常见的恶性骨肿瘤，肿瘤在局部呈侵袭性生长并易发生转移，其中肺转移为其死亡的主要原因[1-2]。细胞的存活和凋亡是生命的矛盾统一现象，肿瘤的生长和凋亡都不能用细胞的周期和凋亡理论进行单独的完整解释，肿瘤是一类细胞增殖异常的病变，在这一过程中细胞的增殖和凋亡的调控通路受到了破坏。镉(cadmium)是1种质软、具有延展性的银白色二价重金属，二价镉离子(Cd2+)可溶于水，与氧、氯、硫等元素形成无机化合物分布于自然界中[3]。研究表明镉是具有致癌和抑癌双重作用的环境重金属，氯化镉(cadmium chloride,CdCl2)对多种癌细胞株有明显的肿瘤抑制效应，但目前 CdCl2对骨肉瘤是否有效尚未见研究[4]。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、细胞与仪器

试剂：人骨肿瘤细胞株 MG-63(中国科学院细胞库)，含血清的完全培养基及不含血清培养基(美国GIBCO公司)，PCR试剂盒(上海硕盟生物)，异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白(武汉博士德)，人骨肿瘤细胞株 MG-63中组织型纤溶酶原激活剂tPA(上海碧云天生物)，含EDTA的胰酶(美国GIBCO公司)，凋亡相关基因Bax(美国Santa Cruz公司)。仪器：细胞培养超净台(苏州净化)，培养箱(美国Queue systems)，倒置相差显微镜(日本奥林巴斯)，高转速冷冻离心机(德国BiofugeStratos)，-80 ℃～4 ℃冰箱(日本松下)，高压消毒箱(美国Tuttnauer)，FACSort流式细胞仪(美国BD公司)，PCR仪(澳大利亚Rotor-gene)。

1.2 细胞培养与传代

人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞培养于含10%胎牛血清及双抗的DMEM培养基中，置于5%CO2、37 ℃孵箱中传代培养。当细胞密度达到4×106以上的时候进行传代，清洗培养基后，用含0.02%EDTA的胰蛋白酶进行细胞消化，倒置显微镜观察细胞回缩即终止消化，加入同体积的含血清的培养基，吹打，5 min 10 000 r/min离心，弃上清，取细胞悬液，计数后接种到新的培养瓶中。

1.3 细胞处理

待细胞贴壁生长至4×106，对数是生长期的细胞予以氯化镉凋亡相关基因Bax的刺激14 h进行细胞的收集。加入tPA刺激U251细胞，对照组未加tPA刺激，然后加入Bax(12.5 μg/ml)的刺激24 h后收集细胞。

1.4 RT-PCR(半定量逆转录聚合酶链反应)方法

取人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞定量100 mg，提取总RNA。取2 μg总RNA行逆转录cDNA，取20 μl作为反应体系。PCR反应由逆转录产物2 μl以及18 s RNA和Caspase-3、Caspase-9的引物共同组成。反应过程按照标准的RT-PCR进行：首先预变性的反应条件为95 ℃、5 mins，接着进行梯度变性反应，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 mins递减，共进行30次的循环。接着对所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过拍摄电泳图像对所得到的电泳结果采用凝胶成像分析系统分析。内参选择18 s RNA作为参照，同样完成以上PCR系统的成像，对得到的半定量结果进行对比分析，通过量化的吸光度积分值进行分析(A值)。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞的凋亡周期

采用Annexin V/PI的方法进行凋亡的检测，细胞离心去除培养基之后冷却至4 ℃，进行细胞洗涤，调整浓度至106/ml，取100 μl的细胞悬液加入Annexin V-FITC和PI，避光15 min之后进行流式检测。

采用API的方法检测细胞的凋亡周期，对收集的细胞加入Annexin V-FITC，室温避光30 min以后用buffer进行洗涤2次，加入不换甲醇的甲醛1 ml进行细胞固定，buffer洗涤2次，加入PI染色剂，静置1 h之后进行流式细胞的检测。

Cyclins/DNA双标流式细胞仪分析人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞的周期特异性，对收集的细胞采用乙醇固定过夜，将固定后的细胞用PBS冲洗2次，用TritonX-100处理5 min 2次，用PBS清洗2次，用BSA稀释抗体，4 ℃过夜，第2天加用羊抗鼠IgG，室温静置20 min，PBS洗涤之后，加入PI和RnaseA进行DNA染色，进行流式细胞检测。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 Annexin V/PI法检测细胞凋亡情况

对数生长的人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞加入氯化镉诱导24 h，凋亡细胞增加了6.8%，加入tPA刺激的人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞再加入氯化镉诱导24 h，凋亡增加至15.2%，加入tPA刺激对人骨肿瘤细胞凋亡影响较只加入氯化镉诱导的凋亡效果更明显，见图1，图2。

图1 氯化镉诱导的人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞凋亡散点图

图2 氯化镉诱导的tPA刺激的人骨肿瘤细胞株MG-63细胞凋亡散点图

2.2 鉴定加入tPA的人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞进入细胞周期

检测人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞加入tPA刺激后细胞增殖的情况，结果显示，处于静止期的人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞加入tPA以后进入细胞周期出现了G2～M期的细胞，如图3。

图3 人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞刺激后细胞增殖的情况

2.3 应用API的方法检测细胞凋亡的细胞周期特异性

氯化镉诱导人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞发生在G1期，氯化镉诱导tPA刺激的人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞，细胞周期发生在G1期，对照组未加tPA几乎没有明显的凋亡发生。

2.4 CyclinE/DNA双标流式细胞术对细胞周期的分析

人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞处在G0期，tPA刺激之后出现在G0、早/晚G1、S2、G2、M期，加入氯化镉诱导之后CyclinE表达下降，细胞阻滞存在G1期。

2.5 2组人骨肿瘤细胞株 MG-63细胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达的影响比较

观察组采用氯化镉诱导，对照组未做处理。观察凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表达，结果显示观察组的Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表达值(1.12±0.56、1.10±0.29)显著高于对照组(0.82±0.31、0.72±0.26)，且差异均具有统计学意义(P<0.05)。随着时间延长，观察组细胞凋亡指数逐渐升高，与对照组比较有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 不同时相血清细胞凋亡指数的变化±s)

注：*为与对照组比较，P<0.05；△为与3 h比较，P<0.05。

3 讨论

骨肉瘤是起源于间叶组织，为青少年最常见的原发恶性骨瘤，大多数情况下肿瘤细胞产生不成熟的骨质或骨，其发展迅速，主要病变部位位于长骨干骷端，侵袭性强，可出现全部组织器官的转移，其中肺部转移较为常见。该病预后较差，经积极治疗后5年的存活率仅为70%[5]。目前主要的治疗方法是手术及全身化疗的综合治疗方法，但是还是存在复发和转移的可能。由于疾病发病隐匿，进展很快，很多患者就诊时已到达晚期，同时目前还缺乏骨肉瘤的诊断和治疗靶标，因此寻找生物学靶标对于疾病的诊治至关重要。本研究探求该病的侵袭机制，寻找靶点基因与疾病的相关性，对该病的治疗和预后判断提供一定的指导价值[6-8]。

肿瘤的发生发展是一个复杂的过程，肿瘤细胞的生存凋亡与细胞周期有关，细胞周期具有高度的保守性，凋亡不会对正常机体需要的细胞产生威胁，能够对不必要的细胞产生精确的生理调控，凋亡与细胞增殖之间有着潜在相关性，很多与增殖关系密切的癌基因与细胞凋亡密切相关。随着对细胞凋亡认识的深入，临床研究发现肿瘤的预后与组织化疗反应明显相关，提示了化疗在骨肉瘤治疗中的重要作用。而骨肉瘤的治疗在近 30 年的时间里进入了平台期，患者的长期生存率并没有明显提高，且有部分患者对目前使用的化疗药物不敏感，探索新的、有效的化疗药物就显得尤为重要。细胞的凋亡具有周期性的特征，往往凋亡的发生是细胞被阻滞在细胞周期的其中一个时相当中，绝大多数的肿瘤化疗是采用该理论诱导细胞在特定的周期内发生凋亡，以杀伤肿瘤细胞[9-11]。然而在已有的研究中相关氯化镉诱导的人骨肿瘤细胞凋亡与细胞周期特异性相关的研究尚未涉及，氯化镉是如何通过细胞周期的特异性阻滞而诱导细胞凋亡的，对凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9活化有何影响，本文对其凋亡的特异性进行了阐述。

人骨肿瘤细胞在人体炎症和外伤的时候会急剧的增殖，当人体的炎症病灶消退以后其状态又趋向稳定[12]。我们在体外对人骨肿瘤细胞株进行培养，在未经刺激的情况下，细胞处于G0期的状态，当细胞被氯化镉诱导之后，发生凋亡的细胞较少，细胞不进入细胞周期，而在此基础上采用人骨肿瘤中组织型纤溶酶原激活剂tPA可以激活人骨肿瘤细胞进入细胞周期，促使细胞增殖，细胞进入了S、G2/M期，细胞凋亡率大大增加了[13-14]。可见细胞凋亡的发生只有在进入到细胞中期之后才被检测到。这也与临床放化疗的治疗作用有一定的相似之处，放化疗对细胞产生打击，使细胞进入细胞周期，细胞的凋亡发生率远高于静止期的肿瘤细胞[15]。

细胞的凋亡是否具有周期特异性，我们通过API的方法对氯化镉诱导的细胞凋亡情况进行检测，在凋亡的早期细胞凋亡出现伴随着膜外翻的现象，API的方法就是利用AnnexinV与此现象的相结合，通过细胞核染色，对凋亡周期特异性进行判断，结果显示，氯化镉诱导的细胞凋亡与周期特异性的凋亡主要发生在细胞周期的G1期。细胞的周期蛋白是一类在细胞周期中特异性表达的蛋白质，可以通过刺激细胞周期的依赖性蛋白激酶使细胞有特异性周期表现，周期蛋白最大的特点就是时相性，CyclinE/DNA双标流式细胞术对细胞周期的分析主要是将细胞CyclinE的表达与细胞处的位置结合分析，可以得到细胞的详细周期信息[16]。CyclinE完全在G1期合成，G0期不会出现CyclinE，其中以晚G1期表达最强，CyclinE可以完全将G0、G1很好的分开，根据本实验结果可见氯化镉诱导的细胞凋亡对人骨肿瘤细胞CyclinE的表达是下降的，细胞在G1期被阻滞，此过程也伴随着凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9的高表达及活化。

综上所述，人骨肿瘤细胞在静止期的时候并没有启动周期进程，进入周期后细胞凋亡才会变得敏感，氯化镉诱导凋亡与人骨肿瘤细胞的周期有密切关系，会发生在特定的时相中，这样也将细胞凋亡和周期特异性做了一个很好的解释，从一方面说明了凋亡的周期性。细胞凋亡在恶性肿瘤中具有重要作用，本研究对氯化镉诱导凋亡做了探索性的研究，对肿瘤的诱导凋亡和治疗来说有着一定的临床指导意义。

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(编辑：甘 艳)

Study on Cadmium Chloride Induced Osteosarcoma Apoptosis and Its Molecular Mechanism

YEBin,CHENLingbin,LIURong.

WuhanPurenHospital,Wuhan,430081

Objective To observe the cadmium chloride induced osteosarcoma apoptosis and cell cycle arrest and the specific activation of caspase,and clarify its molecular mechanism of apoptosis effect induced by cadmium chloride cells.Methods

Cadmium chloride;Osteosarcoma cells;Apoptosis;Cell cycle

430081 湖北省武汉市普仁医院

刘 融

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.11.006

R738.7

A

1001-5930(2016)11-1759-04

2016-01-08

2016-10-12)

AnnexinV/PI and API markers were used by flow cytometry on human bone tumor cell apoptosis and cycle-specific detection,RT-PCR method were used to check Caspase-3,Caspase-9 activation conditions.Results Peripheral blood quiescent for cadmium chloride induced apoptosis was not sensitive,cadmium chloride induced G1phase osteosarcoma cells showed significant apoptosis.Cadmium chloride-induced apoptosis occurred mainly in the G1phase of the cell cycle.Cadmium chloride induced apoptosis in the observation group,the control group was unprocessed,Caspase-3,Caspase-9 mRNA expression values were significantly higher.Conclusion Cell cycle is associated with cadmium chloride induced apoptosis,G1phase of has specific cycle arrest,and caspase activation is involved in apoptosis.