肌肽对局灶性脑缺血损伤大鼠的脑保护作用及其机制

李丹丹，蒋立，王爱红

(南京中医药大学，南京210000)



肌肽对局灶性脑缺血损伤大鼠的脑保护作用及其机制

李丹丹，蒋立，王爱红

(南京中医药大学，南京210000)

目的 观察肌肽对局灶性脑缺血损伤大鼠的脑保护作用，探讨其作用机制。方法 将72只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和肌肽组，每组24只。模型组和肌肽组采用线栓法制作右侧永久性大脑中动脉闭塞(pMCAO)模型，假手术组仅分离血管、不插入线栓。大鼠麻醉清醒2 h，肌肽组灌胃给予600 mg/(kg·d)肌肽水溶液，假手术组和模型组灌胃给予等量无菌生理盐水，均2次/d、连续灌胃7天。三组分别于造模第1、3、7 天各取8只大鼠，检测脑梗死体积分数，检测血清IL-10、TNF-α水平及TNF-α/IL-10，测定脾脏指数。结果 造模第3、7天，肌肽组脑梗死体积分数均较模型组降低(P<0.05或<0.01)。造模第1、3、7天，模型组及肌肽组血清TNF-α、IL-10水平均较假手术组同时间点升高(P<0.05或<0.01)；造模第7天，肌肽组血清IL-10水平低于模型组(P<0.01)。造模第1、3天，模型组TNF-α/IL-10较假手术组同时间点增加(P均<0.05)；造模第7天，模型组TNF-α/IL-10均较假手术组及肌肽组同时间点降低(P均<0.05)。与假手术组比较，模型组造模第3天脾脏指数升高，造模第7天脾脏指数降低(P均<0.01)；与模型组比较，肌肽组造模第3天脾脏指数降低，造模第7天脾脏指数升高(P均<0.01)。模型组、肌肽组脑梗死体积与血清TNF-α水平及TNF-α/IL-10均呈负相关(r分别为-0.852、-0.884，P均<0.05)。结论 肌肽可减轻局灶性脑缺血大鼠脑损伤，抑制炎症反应、改善免疫失衡状态可能是其作用机制。

局灶性脑缺血；肌肽；肿瘤坏死因子α；白介素10；大鼠

脑卒中是临床主要致死性和致残性疾病之一，其中缺血性脑卒中是最常见的类型，约占85%[1,2]。研究发现，免疫相关性炎症反应在脑缺血病理损伤过程中发挥关键作用，其中Th1类细胞分泌的促炎因子TNF-α与Th2类细胞分泌的抗炎因子IL-10比值失衡是促进脑缺血病情发展的重要因素[3,4]。肌肽为一种天然存在于脊椎动物骨骼肌中的生物活性肽，可通过调节机体免疫功能、清除氧自由基等，发挥脑保护作用[5]。2014年12月～2015年6月本研究探讨肌肽对局麻性脑缺血损伤大鼠的脑保护作用及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SPF级SD大鼠94只，体质量(300±20)g，由南京中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(苏)2013-0003。肌肽(美国Sigma公司)，大鼠血清IL-10及TNF-α ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)，SQP电子天平(德国Sartorious)，UXF -80 ℃冰箱(美国Thermo Scientific)，VICTORTMX3多标记检测系统(美国PerkinElmer公司)，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，美国Sigma公司)。

1.2 模型制作及处理 94只大鼠适应性饲养7天，自由进食和饮水，造模前禁食12 h、不禁水。采用线栓法[6]复制右侧永久性大脑中动脉闭塞(pMCAO)模型：10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎CCA和ECA的近端，用动脉夹夹闭ICA，在CCA游离段剪一小口并系一松结，将制备好的尼龙线栓经CCA分支处顺ICA走向缓慢推进入颅内，自线栓标记处(18 mm)进入CCA与ICA分叉部位，系紧小口下松结。以大鼠苏醒后提尾悬拉出现左上肢屈曲，爬行时向左侧转圈或跌倒为模型成功标志。若符合上述症状但有蛛网膜下腔出血，予以剔除并用同一批次造模成功的大鼠随机补足，保证每组大鼠只数相等。最终72只大鼠进入本研究，按随机数字表法分为假手术组、模型组和肌肽组，每组24只。假手术组不插入线栓，仅分离右侧CCA、ECA和ICA后缝合。大鼠麻醉清醒2 h，肌肽组灌胃给予600 mg/(kg·d)肌肽水溶液，假手术组和模型组给予等量无菌生理盐水，均2次/d、连续灌胃7天。三组分别于造模第1、3、7 天各取8只大鼠，采用精密电子天平测量体质量，10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后迅速断头取脑，留取血液标本，取出完整脾脏。

1.3 相关指标观察

1.3.1 脑梗死体积分数测定 取模型组和肌肽组各时间点大鼠脑组织，置于-20 ℃冰箱速冻20 min，自动切片机切片，自额极后间隔2 mm连续取冠状切片5片，并将切片置于TTC溶液中，置于37 ℃恒温避光孵育30 min。待孵育结束后，将脑片放入4%多聚甲醛溶液固定24 h，拍照，红色区域为正常脑组织，苍白区域为梗死区。采用Image Pro-Plus6.0图像处理软件，测量梗死灶体积和对侧正常脑半球的体积，计算脑梗死体积分数。脑梗死体积分数(%)=梗死灶体积/对侧半球体积×100%。

1.3.2 血清IL-10和TNF-α水平检测 取三组各时间点大鼠血液标本，离心取血清，采用ELISA法检测IL-10、TNF-α。采用VICTORTMX3多标记检测系统测量OD值，计算各标本IL-10、TNF-α浓度，及TNF-α/IL-10比值。

1.3.3 脾脏指数测定 取三组各时间点大鼠完整脾脏，剔除周边结缔组织及脂肪组织，生理盐水洗净，滤纸擦干，用精密电子天平测定脾脏质量，计算脾脏指数。脾脏指数=脾脏质量(mg)/大鼠体质量(g)。1.4 相关性分析 采用Pearson相关分析法分析脑梗死体积与血清TNF-α、IL-10水平及TNF-α/IL-10的关系。

2 结果

2.1 三组脑梗死体积分数比较 造模第1、3 和7 天，假手术组脑组织未见灰白色梗死灶，模型组和肌肽组右侧脑组织皮质区及纹状体均有体梗死灶。造模第3、7天，肌肽组脑梗死体积分数低于模型组(P<0.05或<0.01)。

2.2 三组血清TNF-α、IL-10水平及TNF-α/IL-10比较 造模后第1、3、7天，模型组及肌肽组血清TNF-α、IL-10水平高于假手术组(P<0.05或<0.01)；造模第7天，肌肽组血清IL-10水平低于模型组(P<0.01)。造模第1、3天，模型组TNF-α/IL-10高于假手术组(P均<0.05)；造模第7天，模型组TNF-α/IL-10低于假手术组及肌肽组(P均<0.05)。见表1。

2.3 三组脾脏指数比较 造模第3天，模型组高于假手术组，造模第7天低于假手术组(P均<0.01)；造模第3天，肌肽组低于模型组，造模第7天高于模型组(P均<0.01)。见表1。

表1 三组各时间点相关指标比较±s)

注：与假手术组同时间点比较，*P<0.05，#P<0.01；与模型组同时间点比较，△P<0.05，▲P<0.01。

2.4 脑梗死体积与血清TNF-α、IL-10水平及TNF-α/IL-10的关系 模型组、肌肽组脑梗死体积与血清TNF-α水平及TNF-α/IL-10均呈负相关(r分别为-0.852、-0.884，P均<0.05)，与血清IL-10水平无相关性(r=0.194，P>0.05)。

3 讨论

缺血性脑卒中患者影像学检查均显示脑缺血侧存在梗死灶，脑梗死体积是判断缺血性脑卒中的金标准。但脑缺血后缺血侧脑组织水肿对脑梗死体积计算有一定影响。本研究选用脑梗死体积分数评价脑梗死体积，可减少误差。肌肽是由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的内源性二肽，是目前发现的结构最简单的生物活性肽之一，具有调节pH值、清除氧自由基、抗糖基化等生物学作用[7,8]。本研究结果显示，假手术组未见梗死灶，模型组和肌肽组右侧脑组织皮质区及纹状体均有不同程度大小的梗死灶；造模第3、7天，肌肽组脑梗死体积分数均较模型组降低，提示肌肽可抑制脑梗死的发生、发展，且具有一定的时间依赖性。

促炎和抗炎机制的失衡即致炎细胞因子(如TNF-α等)与抗炎细胞因子(如IL-10等)比例失调在脑缺血等心脑血管疾病的发生、发展过程中发挥关键作用。TNF-α是炎性细胞因子网络的中心环节，其合成、分泌增加是脑缺血早期损伤加重的主要原因。IL-10是免疫调节及抗炎细胞因子之一，通过抑制树突状细胞发育成熟的早期阶段，阻断其向T细胞递呈抗原，使T细胞活化能力受损，导致TNF-α、IFN-γ、IL-2等炎性因子分泌显著减少，抑制脑缺血后炎性反应介导的脑组织损伤[9]。在脑缺血病理生理过程中，促炎/抗炎机制动态失衡，炎性反应失控，释放大量促炎细胞因子，加重神经元缺血性损伤[10,11]；亦可出现继发抗炎反应过度亢进，抑制促炎因子分泌，影响免疫细胞的成熟、增殖和分化，发挥强大的免疫抑制作用。因此，保持TNF-α/IL-10平衡可抑制卒中后炎症反应，避免继发性损伤脑组织。本研究结果显示，脑缺血后第1、3天，模型组血清TNF-α水平显著升高，IL-10小幅升高，TNF-α/IL-10显著升高，提示此时促炎反应占主导地位；随着病程延长至脑缺血后第7天，血清IL-10水平上升幅度明显高于TNF-α上升幅度，TNF-α/IL-10明显低于假手术组，提示抗炎反应占主导地位；进一步研究发现，脑梗死体积与血清TNF-α水平及TNF-α/IL-10存在显著负相关；上述结果与Su等[12]研究结果一致，提示检测血清TNF-α和TNF-α/IL-10可早期诊断和预测脑梗死的发生、发展。造模第7天，肌肽组血清IL-10水平低于模型组；TNF-α/IL-10高于模型组，且与对照组接近，推测肌肽脑保护作用可能是通过调节促炎/抗炎细胞因子分泌，制约炎症反应和抗炎免疫应答实现的。

脾脏是机体最大的外周免疫器官，亦是免疫应答的主要场所，机体发生超敏反应时，脾脏质量会增加，因此脾脏指数常作为评估药物对免疫器官抑制作用的基础指标[13～15]。本研究模型组与假手术组比较，脾脏指数造模第3天升高，造模第7降低，提示脑缺血刺激丘脑-垂体-肾上腺皮质轴和交感神经系统，激活免疫抑制反应，造成代偿性抗炎反应综合症；与模型组比较，肌肽组造模后第3天脾脏指数降低，造模后第7天升高，提示肌肽可通过调节脾脏指数，改善免疫功能紊乱，发挥脑神经保护作用。

综上所述，肌肽可减轻局灶性脑缺血大鼠脑损伤；抑制炎症反应、改善免疫失衡状态可能是其作用机制。

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江苏省高效优势学科建设工程项目(YSHL0201-26)；江苏省教育厅高效“青蓝工程”项目。

王爱红(E-mail： wah710630@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.36.010

R743.3

A

1002-266X(2016)36-0034-03

2015-12-16)