腹舒胶囊对慢传输型便秘大鼠肠道传输功能、结肠壁病理结构及SOM的影响研究

贾 涛，赵 宁

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056008)



腹舒胶囊对慢传输型便秘大鼠肠道传输功能、结肠壁病理结构及SOM的影响研究

贾 涛，赵 宁

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056008)

目的 观察腹舒胶囊对慢传输型便秘大鼠模型肠道传输功能、结肠壁病理结构及结肠肌间神经丛生长抑素(SOM)的影响，探讨腹舒胶囊治疗慢传输型便秘的作用机制。方法 取72只SD大鼠，随机选取其中18只作为正常组，给予普通饲料喂养；其余大鼠给予添加大黄的饲料造模。将造模成功后大鼠随机分为模型组、腹舒胶囊组和自然恢复组各18只。腹舒胶囊组和自然恢复组分别给予腹舒胶囊和生理盐水灌胃2周。采用活性炭悬液推进法测定各组大鼠炭末推进长度，光镜及电镜观察各组动物结肠壁的病理及超微结构变化，进行结肠肌间神经丛SOM阳性神经免疫组织化学染色半定量分析。结果 模型组炭末推进长度明显短于正常组(P<0.05);经光镜及电镜观察，模型组可见黏膜慢性炎症改变，神经元及平滑肌细胞呈明显退行性变化，肠壁大量嗜酸性粒细胞浸润；免疫组化染色显示模型组SOM免疫反应性明显低于正常组(P<0.05)。而腹舒胶囊组灌胃2周后炭末推进长度明显长于模型组和自然恢复组(P均<0.05)，肠壁神经病变明显减轻，免疫组化染色显示SOM免疫反应性明显高于模型组和自然恢复组(P均<0.05)。结论 长期应用蒽醌类泻剂对肠神经系统有明显损害作用，并可引起结肠肌间神经丛神经递质的变化。腹舒胶囊可促进结肠肌间神经丛神经递质数量及功能恢复，对于治疗慢传输型便秘有较好的疗效。

慢传输型便秘；大鼠；免疫组织化学；生长抑素；腹舒胶囊

Key words: slow transmit constipation; rat; immunohistochemistry; somtostatin; Fushu capsule

慢传输型便秘(slow transit constipation,STC)是以胃肠道，特别是结肠动力减弱、无便意、大便次数减少为主要特点的顽固性便秘，多伴有长期服用大剂量刺激性泻剂史[1]。生长抑素(SOM)能神经元在肌间丛仅占5%左右，但其对肠道动力的调节作用却不容忽视。SOM可作用于肌间丛抑制NO相关性化合物的释放，从而减弱非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经抑制途径，其可调节慢波的振幅，抑制胃泌素、人胆囊收缩素/肠促胰酶肽(CCK)、血管活性肠肽(VIP)、胰高血糖素等胃肠激素的释放，因而可间接影响结肠运动[2]。结肠壁肌间神经丛SOM的变化在慢传输型便秘发病中的作用已得到证实，且电镜发现慢传输型便秘患者结肠神经丛及平滑肌超微结构的病理改变支持了其存在内源性神经肌肉病变的观点[3]。腹舒胶囊可促进肠道蠕动，并具有双向调节功能，用于治疗慢传输型便秘疗效较好，但其作用机制尚不明确。本研究观察了腹舒胶囊对慢传输型便秘大鼠模型肠道传输功能、结肠壁病理结构及结肠肌间神经丛生长抑素(SOM)的影响，旨在探讨腹舒胶囊治疗慢传输型便秘的作用机制。现将结果报道如下。

1 实验资料

1.1 动物 选用清洁级健康成年SD大鼠72只，雌雄各半，体质量(185.93±3.52)g，由河北省医学科学院实验动物中心提供，合格证号：04057。

1.2 药物 大黄，购于石家庄乐仁堂中药饮片厂，产地甘肃；腹舒胶囊由生白术30 g、大云15 g 、川朴12 g、木香6 g、青皮20 g、五味子15 g、陈皮10 g、黄芪12 g、杭白芍30 g、当归10 g、生熟地各15 g、威灵仙20 g、核桃仁10 g、杏仁10 g、云苓12 g、泽泻10 g、麦冬12 g、荔枝核20 g、枳实10 g组成，河北石家庄平安制药厂代加工。

1.3 试剂 APES试剂，购于北京中山生物技术有限公司；SP-9002型免疫组织化学试剂盒，美国ZYMED公司产品，购于北京中山生物技术有限公司；一抗为兔抗人多克隆抗体，二抗为显色复合物，均为北京中山生物技术有限公司产品。

1.4 方法 大鼠适应性喂养1周后，随机选取18只作为正常组(雌雄各半)，雌雄分笼给予普通饲料饲养；其余大鼠雌雄分笼给予添加有大黄粉的饲料饲养，保持适宜的环境(室温16～25 ℃，相对湿度50%～70%，清洁安静)。大黄粉开始剂量为100 mg/(kg·d),以后每天给予剂量为前1 d的2倍，直至出现半数粪便变稀，然后每天保持此剂量直至80%的稀便消失，再在此基础上加倍给药，又有近半数粪便变稀。如此程序循环3次，待最后一次80%的稀便消失1周后停止给药。本次实验第9天首次出现半数大鼠粪便便稀，大黄粉用量1 600 mg/(kg·d),维持此剂量15 d，80%的大鼠稀便消失；增加大黄粉用量至3 200 mg/(kg·d),再次出现近半数粪便变稀，维持此剂量13 d，80%的大鼠稀便消失；增加大黄粉用量至6 400 mg/(kg·d),再次出现近半数粪便变稀，维持此剂量19 d，80%的大鼠稀便消失，维持此剂量1周后停止给药，饲以普通软饲料待处理。将造模成功后大鼠随机分为模型组、腹舒胶囊组和自然恢复组各18只，雌雄各半。腹舒胶囊组和自然恢复组分别予腹舒胶囊和生理盐水灌胃2周。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠体质量 造模前后及灌胃前后称量大鼠体质量，观察大鼠体质量变化。

1.5.2 肠道传输功能 采用活性炭悬液推进法测定肠道传输功能。模型组大鼠在完成造模后和正常组大鼠一起，腹舒胶囊组和自然恢复组灌胃结束后1周一起均禁食24 h后，经口灌入活性炭悬液1 mL/100 g(悬液浓度100 g/L)，30 min后以颈椎脱臼法处死。立即剖腹取出幽门到直肠末段的全部肠道，在无张力状况下测量肠道全长及活性炭混悬液在肠道内推进长度，最后计算每组的平均值。

1.5.3 结肠壁病理结构和结肠肌间神经丛超微结构变化 大鼠颈椎脱臼处死，迅速剖腹取结肠中段肠管约2 cm，生理盐水冲去肠内容物，放入4%多聚甲醛固定约24 h，行HE染色，观察光镜下结肠壁的变化。另切取结肠中段肠管，冲洗干净后用锋利刀片将结肠壁组织切成3 mm×3 mm×3 mm的小块，浸入2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液(pH 7.2)固定48 h，醋酸铀和柠檬酸铅染色，用超薄切片机切片，厚度50 nm，应用透射电子显微镜观察结肠肌间神经丛超微结构变化。

1.5.4 结肠肌间神经丛SOM免疫组织化学染色半定量分析 根据神经元胞体和纤维的分布密度及活动性强弱做相对半定量比较。所有视野未见阳性细胞为(-)；有少数弱阳性神经元为(+)，染色为淡黄色；阳性细胞较多见为()，染色为棕黄色；阳性细胞多见为()，染色为棕褐色。

2 结 果

2.1 各组大鼠实验前后体质量及肠道外观表现 模型组、腹舒胶囊组和自然恢复组大鼠体质量均明显低于正常组(P均<0.05)，腹舒胶囊组和自然恢复组大鼠体质量与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1。各组动物肠道外观无明显差别，结肠黏膜无色素沉着。

2.2 各组大鼠炭末推进长度比较 模型组炭末推进长度明显短于正常组(P<0.05);腹舒胶囊组、自然恢复组炭末推进长度明显长于模型组(P均<0.05)，但仍短于正常组 (P<0.05)；腹舒胶囊组炭末推进长度明显长于自然恢复组(P<0.05)。见表2。

表1 各组大鼠实验前后体质量比较±s，g)

注：①与正常组比较，P<0.05。

表2 各组大鼠肠管总长和炭末推进 长度比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与自然恢复组比较，P<0.05。

2.3 各组结肠组织光镜下表现 正常组未发现黏膜下层及肌间神经丛病变。模型组可见黏膜慢性炎症；全层大量嗜酸性粒细胞浸润，以固有膜为主，黏膜下肌部分增厚，胶原纤维化，见图1；肌间神经丛神经细胞空泡变性、减少，见图2。腹舒胶囊组肌间神经丛神经细胞空泡变性减轻；自然恢复组改善不明显。

图1 模型组结肠壁黏膜光镜下表现(HE，×40)

图2 模型组结肠壁肌间神经丛神经细胞及黏膜 下肌部分光镜下表现(HE，×100)

2.4 各组结肠组织电镜下表现

2.4.1 正常组 结肠肌间神经丛神经节内神经元较胶质细胞的数量略多，神经元与胶质细胞及其突起组成神经毯；可见到Cajal间质细胞及正常神经元,其胞质内可见丰富的粗面内质网、核糖体，滑面内质网及发达的高尔基体少见；可见正常的平滑肌细胞及无髓神经。

2.4.2 模型组 未找到Cajal间质细胞；神经元明显退行性改变，可见胞质内大部分线粒体空泡变性，嵴排列紊乱，大部分或全部嵴消失；神经胶质细胞内可出现大小不等的空泡及脂褐素等，可见线粒体高度水肿，嵴排列紊乱，大部分消失；粗面内质网有脱颗粒现象。见图3。

图3 模型组结肠组织电镜下表现(EM，×20 000)

2.4.3 腹舒胶囊组 神经髓索、平滑肌细胞、神经胶质细胞退行性变有较明显恢复，神经髓索水肿减轻；平滑肌细胞密体增多，核旁线粒体局部水肿，嵴排列紊乱，部分嵴消失，粗面内质网有脱颗粒现象。见图4。

图4 腹舒胶囊组结肠组织电镜下表现(EM，×5 000)

2.4.4 自然恢复组 神经元、平滑肌、神经胶质细胞退行性变无明显恢复。神经元细胞大量线粒体空泡化，周围大量胶原纤维增生，可见胶原纤维内空泡；神经胶质细胞周围胶原纤维增生，线粒体高度水肿，嵴排列紊乱，大部分消失。

2.5 各组结肠肌间神经丛SOM免疫组织化学结果 SOM阳性细胞以胞浆着色为主，棕黄色，着色深，细胞核为蓝色，见图5。免疫组化染色半定量分析结果显示，模型组SOM免疫反应性明显低于正常组(P<0.05)；腹舒胶囊组免疫反应性明显高于模型组、自然恢复组(P均<0.05)，但低于正常组(P<0.05)；自然恢复组免疫反应性与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

3 讨 论

慢传输型便秘的病因、发病机制尚未完全清楚。相关研究发现，刺激性泻剂如大黄、酚酞、番泻叶等长期作用于结肠黏膜，使肠黏膜感觉信息的传入和平滑肌收缩的信息传出障碍，导致肠蠕动功能失调，引发慢传输型便秘[4]。近年来研究发现，肠神经系统中结肠肌间神经丛的病理改变可能是慢传输型便秘发病的一个重要原因[5]。肠神经系统主要指消化道的壁内神经丛，即黏膜丛、黏膜下丛、肌深丛、肌间神经丛和浆膜下丛。神经丛是由神经节和节间连接组成的网状结构，神经节主要位于肌间丛和黏膜下丛。上述神经丛起始于食管下段，一直延伸到肛管齿线水平，并与胆囊和肝外胆管的壁内神经丛相互连接，形成一个局部神经系统。Hanani等[6]对168例慢传输型便秘患者的研究发现，随着年龄的增加,结肠中的正常神经节及神经丛的数量逐渐减少，神经的退行性变化增加，从而引起肠传输功能下降。Wedel等[7]采用免疫组化技术发现在慢传输型便秘患者肠段中，其肠肌间神经丛和肠黏膜下神经丛中的神经节面积和正常神经元数量都较正常对照组明显较少。因此在慢传输型便秘的治疗中，避免结肠肌间神经丛进一步损伤及促进受损的肠神经系统结构及功能恢复具有重要的意义。

图5 结肠肌间神经丛SOM阳性神经细胞镜下表现(LM，×100) 表3 各组结肠肌间神经丛SOM免疫反应的 半定量分析

只

注：①与正常组比较，P<0.05 ；②与腹舒胶囊组比较，P<0.05。

目前已经确定的肠神经递质或调质多达数十种，其中兴奋性递质主要包括 Ach 、SP、TKS、酪氨酸激酶-C等，抑制性递质以NANC能神经递质为主，如血管活性肠肽、生长抑素、一氧化氮。肠神经递质的多样性决定了其功能的复杂性。SOM能神经元存在于肠肌间神经丛内，其对肠神经系统的抑制作用机制主要在于可减少一氧化氮相关化合物的释放，减弱NANC神经抑制途径。杜丽娟等[8]研究发现，便塞通合剂对慢传输便秘大鼠的结肠传输功能有明显促进作用，这种促进肠动力作用可能与此中药方剂能抑制结肠中SOM、血管活性肠肽等的表达，以及能修复肠肌间神经丛有关。刘丽等[9]发现结肠水疗联合针刺治疗能够改善慢传输便秘患者的症状，治疗后患者体内生长抑素等胃肠激素水平下降。本研究应用大黄建立慢传输型便秘泻剂结肠模型，发现刺激性泻剂可使结肠传输功能及结肠壁肌间神经丛SOM免疫反应性明显降低，对肠神经系统有损坏作用。

祖国医学认为便秘之源在脾胃，脾气虚弱则运化不健，同时便秘与肝、肺、肾有不可分割的关系。因此充分考虑到肺、肝、肾、脾、胃的生理特点，结合现代药理学研究成果拟定了腹舒胶囊，该方对肠道蠕动具有双向调节作用。方中黄芪含有多种氨基酸，对多种祖细胞有促进恢复作用[10]。白术可明显促进小肠蛋白合成，使兔离体肠管自发运动紧张性升高，收缩幅度增大；可延长淋巴细胞寿命，提高IL-2水平，并能增加T淋巴细胞表面IL-2R的表达；具有抗氧化作用，可降低过氧化脂质(LPO)含量，避免有害物质对组织细胞结构和功能的破坏作用，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，增强机体对自由基的清除能力，减少自由基对机体的损伤[11]。而生熟地、当归、枳实均有非特异性抗炎作用[12]。因此，腹舒胶囊可通过改善细胞的营养与能量代谢，降低胶原含量，增加细胞的生命力和抵抗力，促进蛋白合成，提高人体的免疫功能；通过抗氧化酶系统，使体内SOD、过氧化氢酶活性明显增加，使体内LPO明显减少，从而减轻这些危险因素对细胞的损伤；并通过非特异性抗炎及抗菌消炎等作用，促进结肠肠神经丛的修复。

本实验研究发现，给予腹舒胶囊灌胃后，半定量分析显示大鼠结肠肌间神经丛SOM含量明显增加，而自然恢复组改善不明显。证实腹舒胶囊组方可促进慢传输型便秘模型大鼠肌间神经丛肽类递质含量增加,其促肠道动力作用与结肠SOM的分布增加存在密切关系，可能与该组方有促进肠神经丛结构和功能恢复作用有关。

综上所述，长期应用蒽醌类泻剂对肠神经系统有明显损害作用，并可引起结肠肌间神经丛神经递质的变化。腹舒胶囊可促进结肠肌间神经丛神经递质数量及功能恢复，对于治疗慢传输型便秘有较好的疗效，但腹舒胶囊治疗慢传输型便秘的确切机制还需深入探讨。

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Study on the effect of Fushu capsule on SOM in rat with slow transit constipation and relativity of Fushu capsule and pathologic change of colonic myenteric plexus

JIA Tao, ZHAO Ning

(Handan Central Hospital, Handan 056008, Hebei, China)

Objective It is to observe the influence of Fushu capsule on intestinal transmission function, pathological structure of colon wall and the somatostatin (SOM) in the colonic muscular plexus of the rat model of slow transit constipation (STC), and explore the mechanism of the treatment of slow transit constipation. Methods 72 healthy adult SD rats were selected. 18 rats were randomly selected as the normal group, which were fed with normal diet. The rest of the rats were given the feed of rhubarb to produce STC model, and then randomly divided into the model group, the Fushu capsule group and the natural recovery group with 18 cases in each groups. The animals in Fushu capsule group and natural recovery were given Fushu capsule and physiological saline to fill the stomach respectively for 2 weeks. The length of carbon propulsion were measured by activated carbon suspension propulsion method, the pathological and ultrastructural changes of rat colonic wall were observed by light microscope and electron microscope, and the semi quantitative analysis of immunohistochemical staining of SOM positive nerve in the muscular plexus of colon was performed. Results The length of carbon propulsion in model group was significantly shorter than that in normal group (P<0.05). The chronic inflammatory changes were discovered in the mucosa of model group, and the neurons and smooth muscle cells were obviously degenerative, a large number of Eosinophil infiltration in the intestinal wall; Immunohistochemical staining showed that the SOM of model group was significantly lower than that of normal group (P<0.05). 2 weeks after filling the stomach, the carbon propulsion length in Fushu caspsule group was significantly longer than that in the model group and natural recovery group (allP<0.05); the intestinal wall neuropathy was significantly reduced; Immunohistochemical staining showed that SOM immunoreactivity was significantly higher than that of model group and natural recovery group (allP<0.05). Conclusion Long application of danthron purgative is harmful to enteric nervous system. Fushu capsule can promote recovery with the neuropeptide amount and function and pathologic change of colonic muscular plexus.

贾涛，男，博士，副主任医师，主要从事食管癌、肺癌等外科疾病的临床工作。

赵宁，Tel：13363080806

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.18.004

R-332

A

1008-8849(2016)18-1949-05

2015-11-19