miRNA-92a在胃癌血浆中的表达及其意义

张 雪,牛巍巍，杨春春，段志英，范红云，霍晓辉

(1. 河北以岭医院,河北 石家庄 050091；2. 河北医科大学第一医院，河北 石家庄 050031)



miRNA-92a在胃癌血浆中的表达及其意义

张 雪1,牛巍巍2，杨春春2，段志英2，范红云2，霍晓辉2

(1. 河北以岭医院,河北 石家庄 050091；2. 河北医科大学第一医院，河北 石家庄 050031)

目的 探讨miRNA-92a在胃癌患者血浆中的表达及其临床意义。方法 采用实时荧光定量PCR检测80例胃癌患者(胃癌组)及40例健康体检者(对照组)血清miRNA-92a相对表达情况，并计算miRNA-92a在胃癌诊断中的灵敏度和特异度。结果 胃癌组中miRNA-92a表达量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。miRNA-92a与胃癌患者的性别、年龄、H.pylori感染、病理类型无关(P均>0.05)，与TNM分期相关(P<0.05)。miRNA-92a受试者的工作特征曲线下面积为0.871[95%CI(0.800，0. 942)]，区分胃癌患者和健康人群的敏感度和特异度分别为85.7% 和70. 8%。结论 血浆中miRNA-92a可能是胃癌早期诊断的潜在标志物。

胃癌；微小RNA；早期诊断

Key words:gastric cancer; microRNA; early diagnosis

胃癌为常见的消化系统肿瘤之一，居新发癌症的第2位和癌症死亡原因的第3位。在我国，胃癌新增病例和死亡人数均居世界首位，并呈年轻化趋势[1]。中晚期胃癌常规的手术、化疗及放疗效果较差，5年生存率低，但如果能够早期发现、早期诊断并早期治疗，5年生存率可达90%以上[2]。因此如何寻找灵敏度及特异度较高的血清肿瘤标记物从而早期发现、早期诊断胃癌已经成为临床亟待解决的问题。micro RNAs 是近年来新发现的基因表达调节工具，通过负性调控靶基因的表达，在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用，micro RNA 分子与胃癌有着密切的相关性[3-4]。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time qPCR) 检测胃癌患者血浆中miRNA-92a表达水平，并分析其在胃癌早期诊断中的意义，旨在为临床提供理论依据。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集2012年3月—2015年6月在河北医科大学第一医院诊治的胃腺癌(以下简称为胃癌，包括胃食管结合部癌)患者 80例作为胃癌组，均经病理学检查确诊，男45例，女35例；年龄(59.85±10.47)岁，<60岁23例，≥60岁57例。另选同期取健康体检者40例作为对照组，男22例，女18例；年龄(55.47±15.52)岁，<60岁13例，≥60岁 27例。2组性别、年龄比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。本研究符合人体试验伦理学标准，并得到医院伦理委员会的批准；入选者均知情并签署知情同意书。

1.2 方法 收集2组受检者血浆，放置于-80 ℃下保存备用。采用 TrizoL试剂盒说明书提取血浆总RNA，应用紫外线分光光度计测定RNA提取液的OD260吸光光度值，计算浓度及纯度，琼脂糖凝胶中电泳(电泳缓冲液 1×TBE)，检测RNA完整性。 实时荧光定量PCR检测miRNA-92a的表达：首先构建RNA逆转录cDNA体系(12.5 μL):5×Renction Buffer 4 μL，dNTP 1 μL，Rnasin inhibitor 0.5 μL，样品RNA 5 μL，MLVRT 1 μL，Random priomer 1 μL，按照上述体系在 37 ℃下反应60 min，然后在85 ℃下将酶灭活处理5 min。反应结束后的cDNA产物用DEPC水进行5倍稀释；然后建立实时荧光定量PCR扩增反应体系，以U6snR为内参，参照下列反应体系(20 μL)进行：2× Master mix 10 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，cDNA 2 μL，DEPC水。按照上述体系将试剂加入96孔板中，所有反应均设计3个复孔，放在漩涡混匀器上震荡充分混匀，然后短暂离心使反应液沉底，将96孔板放入 Real Time PCR 仪中。热循环反应条件为：95 ℃预变性 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40个循环。相对miRNA表达水平用CT值准确计算，U6snRNA为内参。miR-92qRT-PCR引物序列：5’-TATTGCACTTGTCCCGGCCTG-3’。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，对血清miRNA的拷贝数取对数, 经单样本K-S 检验分析发现胃癌及对照组数据均服从正态分布, 故采用独立样本t检验; 用两独立样本的秩和检验(Mann-WhitneyU检验)分析血清miRNA-92a表达水平与胃癌临床病理参数间的关系; 用受试者工作特征曲线(ROC曲线)的曲线下面积评估血清miRNA-92a作为胃癌诊断及预后评估标志物的特异度和敏感度。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miRNA-92a在2组血浆中的表达 miRNA-92a在胃癌组、对照组中的相对表达量分别为2.95±0.18和1.08±0.89，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 miRNA-92a与胃癌患者临床病理特征的关系 miRNA-92a表达与性别、年龄、H.pylori感染、病理类型无明显关系;与TNM分期相关，其中Ⅰ、Ⅱ期相对表达量明显低于Ⅲ、Ⅳ期(P均<0.05)。见表1。

2.3 血浆中miRNA-92a表达水平在胃癌诊断中的价值 miRNA-92a的ROC曲线下面积为0.871[95%CI(0.800，0.942)]，区分胃癌患者和健康人群的敏感度和特异度分别为85.7% 和70. 8%。

3 讨 论

胃癌的预后与诊治时机密切相关，即使进展期胃癌接受了以外科手术为主的综合治疗或者放疗、化疗治疗，5年生存率仍低于30%，且生活质量低，给家庭及国家带来了沉重的负担；但如果能够早期发现胃癌，并在内镜下早期治疗即可获得根治性效果，5年生存率超过90%，大大节约了医疗资源。但是目前我国早期胃癌的诊治率低于10%，远远低于日本(70%)和韩国(50%)。因此如何早期发现、早期诊断及早期治疗成为降低胃癌患者发病率及病死率的关键问题之一。

临床早期胃癌一般无特异性症状，《2014中国早期胃癌筛查及内镜诊治共识意见》[5]指出胃癌的报警症状包括：消化道出血、呕吐、消瘦、上腹部不适、上腹部肿块等，但是报警症状对胃癌的预测作用目前尚有争议。有研究显示，对有消化不良症状的患者，年龄在45岁以下，无消瘦、吞咽困难和消化道出血等报警症状，上消化道癌的阴性似然比很低，肯定了部分报警症状的价值[6]。但国内一项大规模单中心研究对超过10万例高H.pylori感染背景人群内镜资料进行分析后认为，除吞咽困难和年龄外，其他症状对上消化道癌的预测作用有限；而对胃癌来说，报警症状的作用均非常有限[7]。在我国，有无报警症状并不能作为是否行内镜检查的决策指标，考虑到在有报警症状的人群中单独使用H.pylori“检测和治疗”策略漏检肿瘤风险大，不推荐使用；结合我国内镜检查费用相对较低而普及率高，且胃癌发病率高的现状，对有消化道症状的患者建议行胃镜检查排除胃癌等上消化道肿瘤。而内镜检查较痛苦，许多患者因畏惧检查而耽误了最佳的诊断治疗时机。因此早期发现及早期诊断、早期治疗的希望寄托在肿瘤标记物的检测上。临床上应用的癌胚抗原、CA199、CA125的灵敏度及特异度均较低，故作用有限。目前，血清胃蛋白酶原在早期胃癌的筛查中起到了一定的作用，但仍然具有一定的局限性。有研究表明miRNAs 功能异常是肿瘤发生的一个重要发病机制，miRNAs可通过类似癌基因、抑癌基因或其他方式调控肿瘤的发生、发展和转归过程，表现出与癌基因或抑癌基因相似的生物学作用；并且能与信号通路或原癌基因相互作用，对环境信号作出反应，从而对细胞周期产生影响[8-9]。miRNAs的出现为早期筛查提供了更多的可能。miRNAs 是一组小的可调控基因表达的内源性非编码RNA，长度为19～24 bp。它主要通过与靶标基因3’非翻译区域(3’UTR)的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA 或抑制其翻译，从而参与调控个体生长发育、细胞增殖、凋亡、分化等一系列生命活动。

表1 miRNA-92a相对表达量与临床病理特征的关系

目前关于胃癌相关血清miRNAs的研究较少且结果并不一致。研究发现miRNA-92a、miR-16、miR-25、miR-451及miR-486-5p在胃癌患者血浆中表达水平升高, 可以作为诊断胃癌的标志物[10]。日本学者Tsujiura等[11]研究显示miR-106a在胃癌患者血浆中高表达, 而let-7a则呈低表达, 二者的比值诊断胃癌的敏感度和特异度分别为85.5%和80.0%。笔者前期筛选发现miRNA-92a在胃癌患者血浆中存在异常表达的情况，因此本研究利用实时定量荧光PCR(qRT-PCR) 的方法检测了miRNA-92a在胃癌血液中的表达情况，并分析其与临床病理资料之间的关系，为进一步研究miRNA-92a在胃癌发生发展过程中所起的作用提供依据。

miRNA-92a 是高度保守的miR-17-92 基因簇编码的7 个miRNAs 之一，定位于人基因组第13 号染色体上，该基因在多种恶性肿瘤中呈过表达状态[12]。这个簇包括miR-17，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b-1，miR-92a共6个成员，它们彼此间基因序列高度保守，功能相似。miR-17-92簇在多种肿瘤细胞中的表达显著上调。在肿瘤细胞中，miR-17-92 的表达受癌基因C-myc的调控，C-myc是维持干细胞干性的重要基因，let-7可以抑制它的表达[13]。miR-17-92簇可以抑制细胞循环控制基因 Rb2 的表达，随着白血病细胞的分化miR-17-92 的表达会明显下降，而上调miR-17-92 水平，则白血病干细胞的表达上调，干细胞的分化水平明显受到抑制[14]。进一步研究发现，miR-17-92 是通过降低干细胞调控因子p21 的水平来发挥作用的[15]。鉴于miR-302-367、miR-290-295和miR-17-92 簇在细胞G1期向 S期转变以及细胞分化中的促进作用，它们被认为是特异性的调控胚胎干细胞细胞周期的 miRNAs。有研究发现miR-17-92簇被敲除之后，祖B细胞的凋亡增加，导致祖B细胞向前B细胞的转化过程受损，进而影响胚胎期B细胞的发育[16]。在正常的发育过程中，内皮细胞miR-17-92簇的表达能够促进血管生成。miR-17-92簇是潜在的致癌基因，这些miRNA在多种肿瘤中表达上调，包括造血系统恶性肿瘤以及来自乳腺、结肠、肺、胰腺、前列腺和胃的实体瘤，miR-17-92簇极有可能参与了胃癌的调控，其中miRNA-92a可能是这一过程中重要的调控因子。 Shapiro等[17]研究发现，miRNA-92a在结肠癌中呈高表达，行手术治疗后miRNA-92a表达量较前明显下降；Volinia等[18]研究发现miRNA-92a在胃癌组织中呈高表达；但Ng等[19]研究发现miRNA-92a在胃癌组与正常组比较差异无统计学意义。有研究表明，靶向miRNA-92a 的反义寡核苷酸可以有效抑制胃癌细胞的增殖、促进其凋亡，miRNA-92a 可能是胃癌发生、发展的关键调控因子之一[20]。本研究通过检测人血浆中miRNA-92a的表达量，发现miRNA-92a在胃癌组、对照组中的相对表达量比较差异有统计学意义，提示miRNA-92a与胃癌关系密切，其作用的机制可能与miRNA-92a能够有效促进胃癌细胞增殖，抑制细胞的凋亡而导致胃癌的发生。对患者临床病理资料汇总后发现：miRNA-92a表达量与患者病理学类型不相关，这与以往的研究一致，其原因可能是miRNA-92a仅调控细胞增殖及凋亡，并无组织特异性。Shiotani等[21]研究发现，miRNA-92a与H.pylori感染无关，认为H.pylori感染虽然可以在胃黏膜长期定居而改变胃黏膜miRNA表达量，但胃黏膜miRNA表达量是多基因、多因素共同作用的结果，故H.pylori感染患者miRNA表达量不一定发生改变，这与本研究结果一致。miRNA-92a在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者中比Ⅰ+Ⅱ期相对表达量显著升高，表明miRNA-92a在淋巴转移中起到了重要作用。ROC曲线分析发现，miRNA-92a区分胃癌患者和健康人群的敏感度和特异度分别为85.7% 和70.8%，miRNA-92a作为独立诊断胃癌的生物学指标具有一定的准确性和可行性。

miRNA 作为广泛存在的对基因表达进行调节的分子，主要是通过转录后基因沉默抑制其靶基因而起调控作用。目前，只有小部分miRNA 的生物学功能得到了阐明。而miRNA 生物学功能研究最重要的步骤是在特定的状态下寻找到它调控的靶基因，有研究发现miR-92b介导肿瘤细胞的EMT与PI3K/Akt信号通路的相关性，发现SGC7901细胞转染miR-92b inhibitor 后，Akt 和p-Akt 蛋白水平同步上调；转染miR-92b mimics后，Akt和p-Akt蛋白水平同时下调，表明miR-92b 介导EMT后可能通过PI3K/Akt信号通路以外的途径促进肿瘤细胞的转移[22]。但miRNA-92a所介导的靶基因群尚不清楚，故本课题组将在后续的研究中寻找miRNA-92a 在胃癌细胞中调控的靶基因群，阐明其调控胃癌细胞增殖和凋亡的信号通路。

综上所述，miRNA-92a 在胃癌中发挥着类似癌基因的作用，在胃癌血浆中表达呈现明显升高的趋势，故miRNA-92a有望作为一个新的潜在生物学标记物用于胃癌的早期肿瘤标记物及重要预后指标之一。但有研究表明miRNA-92a在胃肠化组织中也呈现高表达的情况，因此推断胃癌的发生及发展过程可能经历了：慢性胃炎-肠上皮化生-上皮内瘤变(低级别到高级别)-胃癌的过程，而在这一过程中miRNA-92a起了非常重要的作用，但其具体的生物学机制尚不完全清楚。研究的下一步应该扩充样本量，并增加肠化、上皮内瘤变组，在胃癌的不同节点来检测miRNA-92a表达量的异常，以寻找其在胃癌的发生和发展中所起的调控作用，进一步寻找其靶基因群，并分析其可能的致病机制，为胃癌的早期发现及早期诊断提供理论依据。

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Clinical significance of abnormal expression of miRNA-92a in serum of gastric cancer patients

ZHANG Xue1, NIU Weiwei2, YANG Chunchun2, DUAN Zhiying2, FAN Hongyun2, HUO Xiaohui2

(1.Yiling Hospital, Shijiazhuang 050091, Hebei, China; 2.The First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei, China)

Objective It is to evaluate the clinical significance of abnormal expression of miRNA-92a in serum of gastric cancer patients. Methods The expression of serum miRNA-92a were measured by qRT-PCR in both 80 cases of gastric cancer patients and 40 cases of health subjects, and the sensitivity, specificity of diagnostic with miRNA-92a were calculated. Results There was significant difference in miRNA-92a expression between gastric cancer group and control group (P<0.05). The expression of miRNA-92a was related to TNM stage (P<0.05), and was not related to sex, age, H.pylori infection, and pathological type. For discriminating gastric cancer patients from healthy volunteers, the area under the receiver operating characteristic curve was 0.871[95%CI(0.800,0.942)], and the sensitivity and specificity were 85.7% and 70.8%, respectively. Conclusion The level of miRNA-92a in serum may be a potential marker for early diagnosis of gastric cancer.

张雪，女，主治医师，研究方向为医学影像学。

霍晓辉，E-mail:hxh_63@163.com

河北省医学科学研究重点科研计划项目(ZD20140221)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.18.005

R735.2

A

1008-8849(2016)18-1953-04

2016-01-20