山楂叶总黄酮对2型糖尿病大鼠睾丸组织病变的改善作用

阚敏宸

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056008)



山楂叶总黄酮对2型糖尿病大鼠睾丸组织病变的改善作用

阚敏宸

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056008)

目的 研究山楂叶总黄酮(HLF)对2型糖尿病大鼠睾丸组织病变的改善作用。方法 将80只大鼠随机分为正常组、模型组和HLF低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)剂量组，每组16只；除正常组外,其他各组均采用高脂高糖饮食8周后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法制备2型糖尿病大鼠模型；之后正常组、模型组灌胃生理盐水，HLF各组灌胃给予相应药物，每天1次，连续6周。干预结束后，测定各组大鼠空腹血糖水平，称量体质量并计算睾丸指数，测定血清睾酮以及睾丸组织中酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脱氢酶(LDH)和谷氨酰转肽酶(γ-GT)含量；HE染色观察睾丸组织形态结构改变，透射电镜观察睾丸组织超微结构改变。结果 与模型组比较，HLF中、高剂量组大鼠空腹血糖水平均显著降低，体质量及睾丸指数均显著升高，血清睾酮以及睾丸组织中ACP、LDH、γ-GT水平均显著上升，差异均具有统计学意义(P均<0.05)。HE染色后光镜下可见模型组大鼠睾丸曲细精管萎缩、生精细胞脱落且数量显著减少等病理改变，而HLF各组睾丸组织病变呈不同程度改善，以HLF高剂量组效果最显著；电镜下可见模型组睾丸组织胞体缩小、细胞器减少、内质网扩张、脂滴形成、细胞核固缩、等病理改变，而HLF各组睾丸细胞超微结构病变明显改善，以HLF高剂量组最为显著。结论 HLF对2型糖尿病大鼠睾丸组织病变具有一定的改善作用。

山楂叶总黄酮；糖尿病；睾丸；大鼠

Key words: Hawthorn Leaves Flavonoids; diabetes mellitus; testis; rat

睾丸病变是糖尿病最常见的并发症之一，发病率是非糖尿病患者的10倍以上[1]，严重影响着糖尿病患者的生活质量和生命健康。山楂叶为我国传统中药品种，在《本草经疏》及《本草通玄》等典籍中均有记载；山楂叶总黄酮(Hawthorn leaves flavonoids，HLF)是从山楂叶中提取的一类黄酮类化合物，以往研究表明其具有抗氧化、降血脂等多种生物学活性[2]以及保护2型糖尿病大鼠胰腺组织和脑组织等药理学作用[3-4]，但其是否对2型糖尿病大鼠睾丸组织具有保护作用尚未见文献报道。本实验观察了HLF对2型糖尿病大鼠睾丸组织病变的改善作用，现将结果报道如下。

1 实验资料

1.1 药物与试剂 HLF(长春三九生物制药，批号：20140213)；酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷氨酰转肽酶(γ-GT)以及睾酮检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；HE检测试剂盒购自北京博奥森生物工程有限公司；链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司。

1.2 动物 清洁级健康雄性SD大鼠，7周龄，体质量180～220g，由河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2013-1-003，动物合格证号：1503008。

1.3 方法 将80只实验用SD大鼠采用随机数字表法分为正常组、模型组以及HLF低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)剂量组，每组16只；除正常组外，其余各组大鼠经高糖高脂饲料喂养8周后，行腹腔注射STZ(60 mg/kg)破坏胰岛β细胞以制备糖尿病大鼠模型，24 h和72 h后分别检测空腹血糖水平稳定在16.7 mmol/L以上即认定为造模成功。HLF各剂量组分别灌胃给予相应剂量HLF，每天1次，连续6 周；模型组和正常组同步给予等体积的生理盐水灌胃。

1.4 观察项目

1.4.1 空腹血糖水平、体质量及睾丸指数 干预结束后，由尾静脉取血以测定各组大鼠空腹血糖水平并记录；称量各组大鼠体质量，麻醉后取睾丸组织冲洗干净并用滤纸拭干后称质量，以计算睾丸指数：睾丸指数(%)=(睾丸质量/体质量)×100%。

1.4.2 血清睾酮含量 麻醉后经腹主动脉取血并离心取血清，参照试剂盒操作步骤，通过放射免疫法平行测定各组大鼠血清中睾酮含量。

1.4.3 睾丸组织中ACP、LDH、γ-GT水平 取每组其中8只大鼠的睾丸组织，按照各试剂盒操作方法步骤进行处理，然后通过酶标仪平行测定各组大鼠睾丸组织中ACP、LDH、γ-GT水平。

1.4.4 睾丸组织病理形态学变化 取每组剩余8只大鼠的右侧睾丸组织，经4%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片(厚度为5 μm)处理后，行常规HE染色：脱蜡、脱二甲苯、染色、复染、脱水、固封等，然后通过倒置光学显微镜观察各组大鼠睾丸组织结构改变。

1.4.5 睾丸组织细胞超微结构 参照1.4.4方法取左侧睾丸组织后迅速切片并修成1 mm×1 mm×1 mm小块，迅速转移到4 ℃预冷的2.5%戊二醛溶液中固定1 h，然后经常规PBS漂洗、丙酮梯度脱水，Epon812包埋、超薄切片和铅铀双重染色后，通过H-7650型透射电镜观察并照相保存。

2 结 果

2.1 各组大鼠空腹血糖水平、体质量、睾丸指数及血清睾酮含量比较 与正常组比较，模型组大鼠空腹血糖水平显著升高(P<0.05)，体质量、睾丸指数和血清睾酮含量均显著降低(P均<0.05)；与模型组比较，HLF中、高剂量组空腹血糖水平显著降低(P均<0.05)，体质量、睾丸指数及血清睾酮含量均显著升高(P均<0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠睾丸组织中ACP、LDH、γ-GT水平比较 与正常组比较，模型组大鼠睾丸组织中ACP、LDH、γ-GT水平均显著降低(P均<0.05)；与模型组比较，HLF中、高剂量组大鼠睾丸组织中ACP、LDH、γ-GT水平均显著升高(P均<0.05)。见表2。

表1 各组大鼠空腹血糖水平、体质量、睾丸指数及血清睾酮含量比较±s)

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

2.3 各组大鼠睾丸组织结构改变比较 正常组大鼠睾丸组织结构未见异常，睾丸组织曲细精管丰富饱满，生精细胞排列规则，管腔内可见大量精子，见图1；模型组大鼠睾丸组织结构呈现曲细精管萎缩，生精细胞脱落、数量减少，管腔内精子数量严重减少等明显的组织病变，见图2；而与模型组比较，HLF各剂量组睾丸组织病变呈不同程度改善，其中以高剂量效果最为显著，见图3～5。

2.4 各组大鼠睾丸组织细胞超微结构改变比较 正常组大鼠睾丸组织细胞超微结构未见异常，睾丸组织呈现细胞器丰富，细胞核呈圆形或椭圆形，染色质分别于细胞核周围，见图6；模型组细胞呈现胞体缩小、胞核固缩、细胞器减少、内质网扩张、脂滴形成等明显的超微结构改变，见图7；而与模型组比较，HLF各剂量组大鼠睾丸细胞超微结构病变明显改善，其中以HLF高剂量组效果最为显著，见图8～10。

表2 各组大鼠睾丸组织中ACP、LDH、γ-GT水平比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

图1 正常组大鼠睾丸组织结构(HE)

图2 模型组大鼠睾丸组织结构(HE)

图3 HLF低剂量组大鼠睾丸组织结构(HE)

图4 HLF中剂量组大鼠睾丸组织结构(HE)

图5 HLF高剂量组大鼠睾丸组织结构(HE)

图6 正常组大鼠睾丸组织细胞超微结构

图7 模型组大鼠睾丸组织细胞超微结构

图8 HLF低剂量组大鼠睾丸组织细胞超微结构

图9 HLF中剂量组大鼠睾丸组织细胞超微结构

图10 HLF高剂量组大鼠睾丸组织细胞超微结构

3 讨 论

糖尿病已经逐渐发展成为仅次于心脑血管疾病和恶性肿瘤的第三大慢性非传染性疾病，严重危害着患者的生命健康。长期血糖控制不佳的糖尿病患者往往并发多个组织器官损伤，是糖尿病患者致残甚至致死的主要原因。其中，高血糖所致生殖系统损伤发病率在50%左右，严重影响着糖尿病患者的生活质量。近年来研究发现，睾丸组织结构和细胞超微结构病变是该并发症发生发展的重要病理机制[5-6]。

睾酮是维持雄性生殖功能最重要的雄激素，制约着睾丸生精功能，对促进精子发生及成熟意义重大。杜静等[7]和王伟超等[8]研究发现糖尿病可诱导睾丸萎缩、睾酮水平降低，并且睾酮水平与血糖水平呈明显负相关；睾丸质量及睾丸指数也是反映睾丸组织状态的重要指标。LDH、ACP和γ-GT是临床上监测睾丸组织功能的3种标志酶，其中LDH与生精上皮的成熟密切相关，ACP参与睾丸内蛋白质合成，γ-GT促进精子成熟[9]。本实验通过制备2型糖尿病大鼠模型并给予山楂叶总黄酮进行干预，发现经HLF干预6周能够显著降低2型糖尿病大鼠血糖水平，提高睾丸指数和血清睾酮水平及睾丸组织中LDH、ACP、γ-GT水平，提示HLF具有保护睾丸组织结构、改善睾丸组织功能的作用。

相关研究发现，糖尿病大鼠睾丸组织出现曲细精管萎缩变形、排列异常，各级生精细胞排列紊乱、数量减少，生精细胞脱落，部分生精小管内生精细胞消失等病理形态学变化；电镜观察发现，糖尿病大鼠睾丸细胞胞核缩小，核膜增厚，染色质呈块状聚集，脂滴聚积、线粒体扩张，结构模糊不清，嵴消失[10-11]。本实验结果显示，模型大鼠出现睾丸组织曲细精管萎缩，生精细胞脱落、数量减少，管腔内精子严重减少等明显的病理形态学变化；睾丸细胞呈现胞体缩小、胞核固缩、细胞器减少、内质网扩张、脂滴形成等明显的超微结构改变，与上述报道基本一致；经HLF干预6周后， 2型糖尿病大鼠睾丸组织病变及睾丸细胞超微结构病变明显改善。

综上所述，HLF具有抑制2型糖尿病大鼠睾丸组织病变、改善睾丸组织功能的作用。

[1] Kanter M,Aktas C,Erboga M. Protective effects of quercetin against apoptosis and oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rat testis[J]. Food Chem Toxicol,2012,50(3/4):719-725

[2] 张鹏,张培新. 山楂叶总黄酮对2型糖尿病大鼠的保护作用[J]. 中药药理与临床,2015,31(4):114-117

[3] 周少英,苏静. 山楂叶总黄酮对2型糖尿病大鼠脑组织的保护作用[J]. 医学研究杂志,2015,44(12):104-108

[4] 张鹏,张培新. 山楂叶总黄酮对2型糖尿病大鼠胰腺组织保护作用的研究[J]. 中药药理与临床,2015,31(5):72-75

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[6] 刘英姿,刘浩然,周源,等. 山茱萸总皂苷对糖尿病大鼠睾丸病变的改善作用[J]. 中国现代医学杂志,2012,22(22):10-13

[7] 杜静,周钧,杨超,等. 他汀改善实验性糖尿病内皮细胞功能的研究[J]. 中国实验诊断学,2009,13(5):584-587

[8] 王伟超,张洁,刘宽芝,等. 氟发他汀对1型糖尿病大鼠血液、尿液结缔组织生长因子表达与肾脏病变干预作用的研究[J]. 中国现代医学杂志,2009,19(24):3740-3744

[9] 刘英姿，刘浩然，周源，等. 山茱萸总皂苷对糖尿病大鼠睾丸病变的改善作用[J]. 中国现代医学杂志，2012，22(22)：10-13

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The ameliorate effects of Hawthorn Leaves Flavonoids on the testicular tissue lesion in type 2 diabetic mellitus rats

KAN Minchen

(Handan Central Hospital, Handan 056008, Hebei, China)

Objective It is to investigate the ameliorate effects of Hawthorn Leaves Flavonoids (HLF) on the testicular tissue lesion in type 2 diabetic mellitus (T2DM) rats. Methods Eighty rats were randomly divided into five groups: normal group, model group and HLF low (50 mg/kg), medium (100 mg/kg), high (200 mg/kg) dose group, 16 cases in each group. All the rats were made into T2DM models by high-fat diet and injected STZ except the normal group; the drugs or normal saline were given by intragastric administration for 6 weeks, once a day. After the intervention, the level of plasma glucose was determined, the body weight and testis tissue index was calculated, the content of testosterone in serum and ACP, LDH, γ-GT in testis tissue were detected; the histopathological changes of testis tissue was observed by HE staining, the ultrastructure of testis tissue was observed by electron microscope. Results Compared with model group, the level of plasma glucose were significantly decreased, the body weight, the testis tissue index and the content of testosterone were significantly increased, the content of ACP, LDH, γ-GT in testis tissue were significantly increased in HLF high and medium dose groups, there were significant difference (allP<0.05). After HE staining under light microscope, the testicular seminiferous was atrophied, germ cell was ablated and the number was significantly reduced in model group; however, the testicular tissue lesions were improved in different degrees in all the HLF groups, and the effect of HLF high dose group was the most significant. Under the electron microscope, the cell body of testicular tissue was significantly reduced, and organelle was reduced, endoplasmic reticulum was expanded, and lipid droplet was formed, and nuclear was condensed in model group; however, the ultra-structural changes of testicular cells were significantly improved in all the HLF groups, and those of HLF high dose group was the most significant. Conclusion HLF has a protective effect on the testicular tissue of rats with T2DM.

阚敏宸，男，博士，副主任医师，研究方向为神经内科疾病。

河北省科技计划项目(142777114D)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.18.006

R-332

A

1008-8849(2016)18-1957-04

2016-01-10