血管性痴呆大鼠海马区神经营养因子表达及加减薯蓣丸的干预机制

谭子虎，陈 延

(1. 湖北省中医院，湖北 武汉 430060;2. 湖北中医药大学中医临床学院，湖北 武汉 430060)



论 著

血管性痴呆大鼠海马区神经营养因子表达及加减薯蓣丸的干预机制

谭子虎1，陈 延2

(1. 湖北省中医院，湖北 武汉 430060;2. 湖北中医药大学中医临床学院，湖北 武汉 430060)

目的 观察加减薯蓣丸对血管性痴呆模型大鼠行为学及海马区神经营养因子3(NT-3)表达的影响，探讨其改善学习记忆的可能机制。方法 选用SPF级雄性Wistar大鼠60只，随机选取其中20只作为假手术组，其余大鼠采用双侧颈总动脉分次结扎并剪断的方法制作血管性痴呆模型。将造模成功大鼠40只随机分为模型组和中药组各20只，中药组给予0.01 mL/g加减薯蓣丸灌胃，其余2组灌胃等量生理盐水，均1次/d。灌胃8周后进行Morris试验，Morris试验结束后取海马组织采用荧光PCR法检测海马区NT-3表达水平。结果 与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，穿越平台次数减少，平台象限停留时间缩短,大鼠海马区NT-3表达明显下降，差异均有统计学意义(P均<0.05)；与模型组比较，中药组大鼠逃避潜伏期明显缩短,穿越平台次数增加，平台象限停留时间延长,大鼠海马区NT-3表达显著升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论 加减薯蓣丸可能通过提高海马区NT-3表达水平，影响神经突触可塑性，从而发挥对抗血管性痴呆的作用。

血管性痴呆；加减薯蓣丸；海马；神经营养因子

Key words: vascular dementia; Modified Yam Pill; neurotrophin-3

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是仅次于阿尔兹海默病的第二大痴呆类型，占痴呆总数的20%，其认知功能的损失主要由脑血管病变导致。最新的研究发现，神经元、神经胶质细胞和血管细胞之间相互作用可导致脑血管病变及痴呆的发生[1]。神经营养因子3(Neurotrophin-3，NT-3)隶属于神经营养因子家族，目前发现其除了具有神经营养、突触保护等作用外，还具有调节神经元及神经胶质细胞增殖的作用[2]。加减薯蓣丸由已故名老中医吕继端根据张仲景《金匮要略》中治疗虚劳的薯蓣丸化裁而来，更加符合痴呆的病机。先前的临床研究发现，加减薯蓣丸可对非痴呆血管性认知功能障碍进行有效地早期干预[3]。本研究拟通过观察加减薯蓣丸对血管性痴呆模型大鼠行为学及海马区NT-3表达的影响，探讨加减薯蓣丸改善学习记忆的可能机制，为加减薯蓣丸干预血管性痴呆的作用机制提供实验依据。

1 实验资料

1.1 实验动物 健康成年SPF级Wistar雄性大鼠60只，鼠龄8～10周，体质量(200±20 )g，购自湖北省疾控中心，动物合格证号：SCXK(鄂)2008-0005。大鼠购买后养殖于自然光线下，保持温度20～25 ℃，恒温恒湿，自由进食进水，适应性饲养1周。

1.2 药物与试剂 加减薯蓣丸由山药、熟地黄、何首乌、西党参、白芍、全当归、炙远志等14味中草药组成，经物理方法浓缩提纯为每毫升含原药材1 g，置于4 ℃冰箱中冷藏，备用。所用药材购自湖北省中医院中药房，由该院药材制剂科制备。引物由Invitrogen Biotechnology Co., LTD中国公司合成。

1.3 主要实验仪器 MT-200 Morris水迷宫视频跟踪分析系统(成都)；image-pro plus图像处理系统6.0(美国)；Neofuge 15R台式高速冷冻离心机(Heal Force)；SLAN荧光定量PCR检测系统(上海宏石医疗科技有限公司)；SW-CJ-1FD超净工作台(苏净安泰)。

1.4 方法 将动物饲养1周后，随机选取其中20只作为假手术组，余大鼠采用颈总动脉分次结扎并剪断的方法制备血管性痴呆模型：给予10%水合氯醛0.3 mg/100 g腹腔注射麻醉，于手术台固定，去毛备皮，碘伏消毒，用手术刀沿颈部正中偏右切开皮肤，逐层分离，钝性分离右侧颈总动脉，用0号手术线结扎右侧颈总动脉的近心端和远心端，用剪刀从中间剪断，依次逐层缝合，1周后在同样条件下结扎并剪断左侧颈总动脉。假手术组在相同条件下只分离双侧颈总动脉，既不结扎也不剪断。术中以60 W灯泡照射,以防止低温,保护脑组织。所有动物手术后暴露在同等条件下：室温24 ℃左右,相对湿度(40±5)%,喂饲普通饲料,自由饮水。术后1周内肌肉注射青霉素预防感染。模型制备后，手术大鼠进行一次Morris水迷宫定位航行训练,以假手术组大鼠从不同入水点爬上站台消耗时间(即逃避潜伏期)的均值为参考值,计算每只大鼠的平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期时间的比例,该值>20%定为痴呆鼠。最终选取造模成功大鼠40只，随机分为模型组和中药组,每组20只。中药组于造模成功1周后开始给予0.01 mL/g加减薯蓣丸灌胃，1 mL/100g体质量,假手术组、模型组予等量生理盐水，均1次/d，连续8周。

1.5 观察项目

1.5.1 行为学检测 各组动物于灌胃8周后，采用Morris水迷宫实验装置及动态图像采集分析系统进行定位航行及空间探索实验,测试各组大鼠的学习及空间记忆能力。水迷宫实验开始前1 d，先让大鼠于无平台水池中试游2 min；水池直径150 cm,高45 cm；保持水温在(22±2)℃。水迷宫实验的第1—4天进行大鼠的定位航行测试: 水池由人为划分成4个象限,在池中第1象限安置1个黑色平台，平台位于水下1 cm，直径12 cm，高21 cm。按1—4象限的顺序，将大鼠从不同入水点放入水池中,由计算机记录大鼠在120 s内,从不同入水点爬上站台消耗的时间(即逃避潜伏期)。如果大鼠在2 min内爬上了站台,则让大鼠在站台停留30 s,逃避潜伏期则为消耗的时间；如果未能找到站台,则可以引导大鼠，让其爬上站台并同样停留30 s,潜伏期相应的记录为2 min。每次训练完成后，将大鼠从水池取出，用干布擦干，并用取暖器保持大鼠体温，实验进行时关闭周围光源，并减少人员走动。第5天拆去站台，对大鼠进行空间探索实验,从同一象限放入水中，计算机记录2 min内大鼠穿越原有站台位置的次数及游动的速度。

1.5.2 海马组织NT-3表达检测 于行为学实验结束后当天，各组动物分别断头取脑组织(海马),用荧光PCR法测定NT-3表达情况。

2 结 果

2.1 Morris水迷宫实验

2.1.1 定位航行实验 经过4 d训练，各组大鼠逃避潜伏期均逐渐变短，但模型组逃避潜伏期明显长于假手术组(P<0.05)，中药组逃避潜伏期明显短于模型组(P<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠的逃避潜伏期

2.1.2 空间探索实验 与假手术组比较，模型组穿越平台次数和游动速度均明显下降(P均<0.05)；与模型组比较，中药组穿越平台次数和游动速度均显著增加(P均<0.05)。见图2及图3。

2.2 海马组织NT-3表达水平 与假手术组比较，模型组大鼠海马组织NT-3表达水平明显降低(P<0.05)；与模型组比较，中药组大鼠海马组织NT-3表达水平明显升高(P<0.05)。见图4。

图2 各组大鼠穿越平台次数

图3 各组大鼠游动速度

图4 各组大鼠海马NT-3表达水平

3 讨 论

血管性痴呆是由脑血管病及其危险因素所导致的疾病，并且随着人类生活方式的改变，高血压、糖尿病、高血脂症的发生率在不断上升，间接地影响着血管性痴呆的发生率[4]。认知功能与大脑皮质功能密切相关，而血管性痴呆的发生与海马的功能有关，在慢性脑灌注不足时，海马等区域对缺氧缺血特别敏感，也最容易受到损伤而导致认知功能下降。目前研究发现，突触变化与记忆的巩固及适应性行为的发生密切相关，而神经营养信号通路在突触生长及可塑性中发挥着重要作用[5-6]。NT-3及与其具有高亲和力的受体TrkC在中枢神经系统中发挥重要作用，神经元的分化、轴突的生长、突触的可塑性等都离不开其营养作用[7-8]。Ramos-Languren等[9]通过在大鼠海马内注射NT-3发现，其可诱导海马DG-CA3神经投射LTP的增强，并伴有海马苔藓纤维突触的改变，而这种作用可被受体TrkC抑制剂所限制。近年来，影响突触发生的黏附复合物不断被发现，而对于其调节机制研究不多。有研究发现，突触后的受体TrkC通过与突触前蛋白酪氨酸磷酸酶σ(presynaptic protein tyrosine phosphatase σ，PTPσ)的相互作用，形成TrkC /PTPσ复合物，诱导细胞黏附反应，发挥谷氨酸能神经突触样作用，而NT-3可增强大鼠海马神经元TrkC的活性，促进PTPσ与TrkC的结合，有助于突触作用的发挥[10]。另外，也有研究发现，NT-3通过激活钙调蛋白依赖性激酶(CaMK)IIα，作用于瞬时型感受器点位通道蛋白5(transient receptor potential canonical 5 protein，TRPC-5)形成钙流，抑制神经突触的生长[11]。

目前国内外对于控制血管性痴呆的进程尚无有效的药物，从中医药宝库中寻找方法和药物不失为一种选择。血管性痴呆在中医属“呆病”范畴，中医认为其由髓减脑消，神机失用引起[12]。髓海不足，脑髓空虚，脑窍失于濡养，导致智能低下、健忘等。髓由精所化，而精藏于肾，故髓由肾所主。肾精充足，则上充髓脑。肾藏先天之精，秉承于父母，需要有后天之精经由五脏六腑之精所充养，故脑髓充盈与肾精及五脏六腑之精密切相关。脾属土，位居中央，为气血生化之源，脏腑之精充盛，与脾胃密不可分，因此补养脾肾，使脏腑精气血得养，髓脑充盈，则脑主司精神、意识、思维等生理功能活动得以发挥，从而主宰生命运动。故对脑病的治疗，尤以虚性病变，常采用补养之法治疗[13-14]。加减薯蓣丸具有健脾补肾之功，方中何首乌制用补益精血，其主要成分二苯乙烯苷对于大鼠海马超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量、自由基代谢具有改善作用，另外可以拮抗β淀粉样蛋白和过氧化氢所致的神经细胞存活率下降，具有神经保护作用[15]。熟地黄补血养阴，填精益髓，其有效成分地黄寡糖可通过提高海马乙酰胆碱的含量改善认知功能[15]。山药补益三焦，其富含薯蓣皂苷元、黏液质、胆碱、游离氨基酸等物质，可提高人体细胞免疫及体液免疫功能，并有降血糖、抗氧化等作用[16]。

本实验结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，穿越平台次数减少，平台象限停留时间缩短,大鼠海马区NT-3表达水平明显下降；与模型组比较，中药组大鼠逃避潜伏期明显缩短,穿越平台次数增加，平台象限停留时间延长,大鼠海马区NT-3表达显著升高。提示模型大鼠的空间学习和记忆能力损伤，而加水平减薯蓣丸可改善模型大鼠学习和记忆能力，具有神经营养及保护功能。

综上所述，加减薯蓣丸可能通过提高海马区NT-3表达水平，影响神经突触可塑性，从而发挥对抗血管性痴呆的作用，这一研究有助于对加减薯蓣丸治疗血管性痴呆的机制有更好的认识。

[1] Iadecola C. The pathobiology of vascular dementia[J]. Neuron,2013,80(4):844-866

[2] Qu Y,Duan Z,Zhao F,et al. Telomerase reverse transcriptase upregulation attenuates astrocyte proliferation and promotes neuronal survival in the hypoxic-ischemic rat brain[J]. Stroke,2011,42(12):3542-3550[3] 谭子虎,兰汉超,杨琼,等. 加减薯蓣丸对非痴呆血管性认知功能障碍早期干预的临床研究[J]. 中国中西医结合杂志,2013,33(1):27-30

[4] Gorelick PB. Status of risk factors for dementia associated with stroke[J]. Stroke,1997,28(2):459-463

[5] McAllister AK,Katz LC,Lo DC. Opposing roles for endogenous BDNF and NT-3 in regulating cortical dendritic growth[J]. Neuron,1997，18(5):767-778

[6] Mayford M,Siegelbaum SA,Kandel ER. Synapses and memory storage[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol，2012，4(6)：a005751

[7] Paul J,Gottmann K,Lessmann V. NT-3 regulates BDNF-induced modulation of synaptic transmission in cultured hippocampal neurons[J]. Neuroreport,2001,12(12):2635-2639

[8] 李爱丽. 全脑缺血再灌注血管性痴呆大鼠海马和丘脑NT-3及FGF的动态变化[J]. 吉林大学学报：医学版,2006,32(1):57-60

[9] Ramos-Languren LE,Escobar ML. Plasticity and metaplasticity of adult rat hippocampal mossy fibers induced by neurotrophin-3[J]. Eur J Neurosci,2013,37(8):1248-1259

[10] Ammendrup-Johnsen I,Naito Y,Craig AM,Takahashi H. Neurotrophin-3 enhances the synaptic organizing function of TrkC-protein tyrosine phosphatase sigma in rat hippocampal neurons[J]. J Neurosci,2015,35(36):12425-12431

[11] He Z,Jia C,Feng S,et al. TRPC5 channel is the mediator of neurotrophin-3 in regulating dendritic growth via CaMKII alpha in rat hippocampal neurons[J]. J Neurosci,2012,32(27):9383-9395

[12] 周仲瑛. 中医内科学[M]. 北京：中国中医药出版社，2007

[13] 谢颖桢,邹忆怀,张云岭,等. 血管性痴呆病因病机探讨[J]. 北京中医药大学学报,2000,23(6):1-3

[14] 唐学敏,张运克,周英武,等. 补肾益气活血法治疗血管性痴呆病经验[J]. 中医杂志,2013,54(11):968-969

[15] 韩飞,荆志伟,于亚南,等. 中药有效成分治疗血管性痴呆的研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志,2012,18(7):273-276

[16] 高学敏. 中药学[M]. 北京：中国中医药出版社，2002

Study on the expression of neurotrophin in the hippocampus of vascular dementia rats and the intervention mechanism of Modified Yam Pill

TAN Zihu1, CHEN Yan2

(1. Hubei Provincial Hospital of TCM, Wuhan 430060，Hubei, China; 2. Clinical College of Chinese Medicine, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430060, Hubei, China)

Objective It is to observe the influence of Modified Yam Pill (MYP) on the expression of Neurotropin-3 (NT-3) in the hippocampus of vascular dementia rats, and explore the possible mechanism of improving learning and memory. Methods 60 cases of male Wistar rats in SPF grade were selected, 20 cases of them were randomly selected as sham operation group, and the others were treated by bilateral common carotid artery ligation and cut to make vascular dementia model. 40 cases of successful rat model were randomly divided into model group and Chinese medicine group with 20 cases in each groups, the animals were given 0.01 mL/g MYP to fill the stomach in Chinese medicine group, and the other two groups were given the same amount of normal saline, 1 times per day. Morris test was carried out after 8 weeks of filling the stomach, the hippocampal tissue was taken to detect the expression level of NT-3 using fluorescence PCR method after the Morris test. Results Compared with sham operation group, the escape latency was significantly longer, and the number of cross platform was reduced, and the platform quadrant dwell time was shorter, and the expression of NT-3 in hippocampus was decreased significantly in the model group, there were significant difference (allP<0.05). Compared with model group, the escape latency was significantly shorten, and the number of cross platform was increase, and the platform quadrant dwell time was longer, and the expression of NT-3 in hippocampus was increased in the Chinese medicine group, there were significant difference (allP<0.05). Conclusion MYP can enhance the expression of NT-3 in the hippocampus, and affect the plasticity of the synapse, so as to play a role in anti vascular dementia.

谭子虎，男，博士，教授，主任医师，主要从事中西医结合治疗心脑血管疾病的研究工作。

湖北省科技厅自然基金资助项目(2010CDB11002)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.18.001

R-332

A

1008-8849(2016)18-1939-04

2015-11-10