电针委中穴对大鼠退变腰椎间盘组织中Bcl-xL、Bax表达的影响①

何挺超，陈少清，林建平，刘午龙，夏梦,3，王诗忠

电针委中穴对大鼠退变腰椎间盘组织中Bcl-xL、Bax表达的影响①

何挺超1，陈少清1，林建平2，刘午龙1，夏梦1,3，王诗忠1

目的 观察电针委中穴对大鼠腰椎间盘退变组织中抗凋亡因子Bcl-xL、凋亡因子Bax蛋白表达的影响。方法 30只雄性Sprague-Daw ley大鼠随机分为假手术组(n=10)、模型组(n=10)和电针委中组(n=10)。模型组和电针委中组通过纤维环穿刺法建立大鼠腰椎间盘退变模型。造模成功1个月后，电针委中组予电针委中穴，连续4周。HE染色观察组织形态，免疫组化法观察退变腰椎间盘组织中Bax蛋白表达，Western blotting检测Bcl-xL、Bax蛋白表达。结果 HE染色显示，腰椎间盘组织退变程度由轻至重依次是假手术组、电针委中组、模型组。模型组Bcl-xL蛋白表达量低于假手术组(P＜0.05)，Bax蛋白表达量明显高于假手术组(P＜0.01)；电针委中组Bcl-xL蛋白表达量显著高于模型组(P＜0.001)，Bax蛋白表达量明显低于模型组(P＜0.01)。结论 电针委中穴治疗腰椎间盘退变，可能与上调Bcl-xL蛋白表达并抑制Bax蛋白表达有关。

腰椎间盘退变；电针；委中穴；凋亡因子；大鼠

[本文著录格式] 何挺超，陈少清，林建平，等.电针委中穴对大鼠退变腰椎间盘组织中Bcl-xL、Bax表达的影响[J].中国康复理论与实践,2016,22(11):1264-1268.

CITED AS:He TC,Chen SQ,Lin JP,et al.Effects of electroacupuncture atWeizhong on expression of Bcl-xL and Bax in ratswith lumbar disc degeneration[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(11):1264-1268.

腰痛属于中医“腰痛”“腰腿痛”“痹症”范畴，作为一类常见病症，危害人们健康，对患者的生活和工作能力造成影响与限制[1]。引起腰痛的原因很多，1974年Steindler首次提出腰痛与椎间盘退变相关[2]，并且得到广泛认可与重视。对此有研究表明，凋亡和抗凋亡因子的表达以及两者之间的动态平衡结果与椎间盘退行性改变密切相关[3]。本研究通过电针委中穴干预大鼠腰椎间盘退变，观察抗凋亡因子Bcl-xL、凋亡因子Bax在退变腰椎间盘组织中的表达情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级Sprague-Daw ley雄性大鼠30只，3月龄，体质量250～300 g，由上海实验动物中心提供，许可证号SCK(沪)2012-0002。按照随机数字表法将饲养1周的大鼠进行分笼分组：假手术组、模型组和电针委中组，每组10只。

1.2 主要实验设备及试剂

低温离心机：美国BECKMAN公司。金属恒温箱：上海精宏实验设备有限公司。石蜡包埋机：湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司。华佗牌G6805电针仪：苏州医疗用品厂。Motic Med 6.0显微生物图像分析系统：麦克奥迪公司。兔抗鼠多克隆抗体Bax：北京博奥森生物技术公司。兔多克隆抗体Bcl-xL、兔多克隆抗体Bax：Cell Signaling Technology。免疫组化试剂盒即用型：福州迈新生物技术有限公司。Sub-Cell GT电泳仪、Image Lab凝胶成像系统：美国BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 造模

模型组和电针委中组大鼠术前禁食12 h，并予以称重记录。分别以10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉，备皮。仰卧位固定，取右侧旁正中切口，暴露腹后壁，剪开后腹膜，肠子转移到左侧，将腰大肌和深层肌肉的附着点从椎体附着处钝性剥离，注意保护周围神经及血管，然后依次暴露L3/L4、L4/L5、L5/L6椎间盘。充分暴露操作视野后，采用21G腰椎穿刺针对上述节段腰椎间盘行纤维环穿刺术，穿刺角度与椎间盘矢状面保持45°～60°，与椎间盘上下软骨终板平行入针并停留10 s再退出，穿刺深度为3mm。术后顺次缝合皮下筋膜及皮肤。

假手术组仅切开皮肤后缝合，不做纤维环穿刺法造模处理。术后予青霉素5万U/只肌肉注射，连续3 d，以预防术后感染死亡。

造模后同等条件下饲养1个月。每组随机取1只大鼠，通过HE染色，验证模型。假手术组大鼠的腰椎间盘可观察到其四周的纤维环结构完好，同时排列有序，位于中心的髓核网状结构完整。另两组纤维环细胞肿胀甚至断裂，明显紊乱，中心是退化的髓核网状结构，体积减小，呈纤维软骨样改变，验证模型成功。

1.3.2 干预方法

假手术组和模型组正常喂养。电针委中组在造模1个月后予电针委中穴，取穴法参照李忠仁《实验针灸学》[4]，其余同前。针灸针(直径0.16mm，长10 mm)直刺大鼠双侧后肢委中穴和非穴点，深度0.5 cm，并予针柄接上电针仪(G-6805华佗牌)的正负极，疏密波波形，以下肢出现轻微颤抖为度(2 Hz,2 mA)，每次20m in，每天1次，连续治疗4周[5]。

1.3.3 取材

干预结束后，所有大鼠以过量10%水合氯醛腹腔注射处死。大鼠取俯卧位，将其后背正中皮肤切开，并予逐层分离腰椎两侧的肌肉韧带，剪取所需节段腰椎椎体置于冰面上(已包含椎间盘)，并依次快速取出L3/L4、L4/L5、L5/L6椎间盘组织，同时L3/L4、L4/L5椎间盘组织置于4%多聚甲醛中固定，待测；L5/L6椎间盘组织迅速放入-80℃超低温冰箱中保存，待测。

1.3.4 HE染色

将L3/L4、L4/L5椎间盘组织放入4%多聚甲醛中固定24 h，10%乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)脱钙8周，每周更换1次，而后水洗、常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，HE染色，显微镜下利用无偏体视学(unbiased stereology)技术，每张切片随机取3个不同视野(400×)纤维环和髓核图片。根据观察结果并结合参照Masuda等[6]对椎间盘形态变化研究，判断其退变程度。

1.3.5 免疫组化染色

组织切片经常规脱蜡各15m in、酒精脱水各5 m in，再经热抗原修复10m in，此过程须浸泡于枸橼酸钠中(液体没过组织)；适时滴加试剂一室温孵育10 m in；试剂二封闭30m in(倾去，勿洗)；滴加现用现配的一抗于湿盒并于4℃过夜；第二天室温复温30 m in，滴加试剂三、试剂四室温孵育10min；配制DAB，显色90 s，自来水充分冲洗。上述步骤除滴加试剂二封闭外，其余每个步骤期间均以PBS浸洗3

次，每次5min。经苏木素染色，盐酸分色1 s，自来水返蓝，封片，显微镜下观察，同时每张切片随机选取高倍(400×)视野3张。采用Motic Med 6.0显微生物图像分析系统统计阳性细胞数及总细胞数，计算Bax蛋白表达阳性率，取均值。

1.3.6 Western blotting

于-80℃超低温冰箱中取出各组腰椎间盘组织，称重，约40～50mg，于冰块上剪碎组织后加入配好的裂解液240～300μl，于冰块中静置约30m in，期间每10 m in快速振荡1次，4℃、14,000 r/m in离心30 min，吸取上清液即为蛋白样品，所取上清液经BCA法测蛋白含量(详细依照试剂盒)，绘制标准曲线。在样品中按1∶4加入4×上样缓冲液，蛋白经定量、变性后，进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，至溴酚蓝指示剂刚跑出胶板即可终止电泳。根据目标蛋白Bax(20 kDa)和Bcl-xL(30 kDa)分子量，按Marker条带分布切取需要电转的胶。转膜时，材料放置顺序为黑胶板(-)—多孔海绵(滤纸2层)—凝胶—NC膜(滤纸2层)—多孔海绵—(+)白胶板，完成转膜后，室温封闭2 h，分别加入Anti-Bcl-xL(1∶1000)；Anti-Bax(1∶1000) 4℃过夜。第二天，1×TBST洗膜5m in，共5次，加入二抗(1∶5000)室温孵育1 h，1×TBST液洗膜5 m in，重复5次，ECL法显影，以β-actin作为内参物，应用BIO-RAD凝胶成像系统采集所需图像，收集整理数据分析。

1.4 统计学分析

选用SPSS 18.0软件对实验所得的数据进行分析。用(±s)表示计量资料，若符合正态分布和方差齐性则采用单因素方差分析；否则进行非参数检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 HE染色

假手术组椎间盘纤维环层次清晰，其纤维环细胞数量未见异常，同时呈同心圆排列，未曾出现破裂或皱缩的情况；髓核呈凝胶样外观，髓核细胞量多且均处于正常的形态排列状态。

模型组椎间盘纤维环层次紊乱较为明显，同时其纤维环细胞数量减少也较为明显，并且纤维环严重撕裂，扭曲，轮廓模糊不清，呈破絮状；髓核明显皱缩，其髓核细胞数量减少明显，并可见大范围的细胞坏死。

电针委中组椎间盘纤维环层次虽有紊乱，但其程度轻于模型组，其纤维环细胞数量减少较少，仅可见局部出现轻度皱缩，扭曲；髓核皱缩较模型组轻微，仍可见其凝胶样外观，同时髓核细胞可见不同程度的变形，甚至小部分坏死。

三组大鼠的腰椎间盘组织退变程度不同，由轻至重依次是假手术组、电针委中组、模型组。见图1～图2。

2.2 免疫组化染色

假手术组中椎间盘纤维环细胞Bax蛋白表达不明显，多呈弱阳性或阴性表达，细胞染色较浅；模型组明显可见较深的棕褐色颗粒，其表达多呈强阳性；电针委中组呈阳性或弱阳性表达，其染色浅于模型组，数量也较模型组少。见图3。

2.3 Western blotting

模型组Bcl-xL蛋白表达量低于假手术组(P＜0.05)，Bax蛋白表达量明显高于假手术组(P＜0.01)；电针委中组Bcl-xL蛋白表达量显著高于模型组(P＜0.001)，Bax蛋白表达量明显低于模型组(P＜0.01)。见表1、图4。

图1 各组纤维环形态改变(HE染色，400×)

图2 各组髓核形态改变(HE染色，400×)

图3 各组椎间盘纤维环细胞Bax蛋白表达(免疫组化染色，400×)

图4 各组椎间盘纤维环细胞Bcl-xL、Bax蛋白表达

表1 各组腰椎间盘组织中Bcl-xL、Bax蛋白表达结果

3 讨论

针灸在临床上治疗“腰痛”“腰腿痛”“痹症”，是常用而行之有效的治疗手段之一，并且经过长期临床实践检验。委中穴位于膀胱经，属于该经五腧穴中的合穴，同时也是其下合穴，在《针灸大全》更是记述了其作用，即“腰背委中求”；同时“经脉所过，主治所及”是针灸治病重要的治疗指导原则之一，突显委中穴在治疗腰背部疾病的重要地位。电针委中穴能够疏经通络，致使“通则不痛”，并且能运行气血津液，从而能濡养、治疗经脉所过的腰背部，使之“荣则不痛”。已有研究表明，腰背部脊髓段与支配委中穴的传入神经在脊髓段的投影对应区有所重合[7-8]。因此可以通过刺激委中穴，刺激相应部位的感受器及传入神经，提高其相对区域的痛阈和耐痛阈，从而提高治疗效果，这也得到临床实践的肯定[9-12]。

本团队长期研究证实，电针委中穴能够治疗或者延缓腰椎间盘退变，而细胞的凋亡与抗凋亡之间的关系失衡是造成腰椎间盘退变的原因之一。其机制可能是通过改变和平衡抗凋亡因子，降低凋亡因子的表达来发挥作用。Bcl-2家族作为能够决定细胞凋亡与否的蛋白家族，其中Bcl-xL、Bax是Bcl-2家族蛋白的重要成员[13-14]。Bcl-xL作为抗凋亡的重要因子[15-16]，具有阻止细胞凋亡作用，是由于其本身具备BH1-4结构，能够通过抑制存在于线粒体上的通透性转换孔(permeability transition pore,PTP)开放，从而阻止细胞凋亡发挥重要作用[17-18]。此外，Bcl-xL抑制细胞凋亡的部分原因是阻断了细胞色素C(Cytc)从线粒体释放，这是与Bcl-xL可以通过抑制线粒体上的高电导通道蛋白(MTP)的开放的功能相关，而Cytc是凋亡蛋白酶激活的关键因素[19-20]。本实验通过检测Bcl-xL蛋白在各组

表达情况发现，电针委中组中Bcl-xL蛋白的表达较其余两组升高(P＜0.05)。HE染色形态学结果表明，电针委中穴能促进抗凋亡因子Bcl-xL表达，从而阻止细胞凋亡，以达到延缓腰椎间盘退变。

Bax在正常情况下位于细胞浆中，其作用是促进细胞凋亡[21-22]，作为促凋亡因子家族中的一员，主要是通过与Bcl-2相结合，期间通过造成两者比例失衡，从而灭活Bcl-2抗凋亡作用，以达到诱导细胞凋亡的目的；而在凋亡的整个过程中，既能造成抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达减少，又能促进凋亡因子Bax蛋白表达，致使两者比例下降[23-25]。本实验检测Bax蛋白的表达发现，电针委中组与模型组中Bax蛋白表达较假手术组有所增高，同时前者促凋亡因子Bax蛋白表达低于后者且效果明显(P＜0.05)，并结合HE染色表达情况，说明电针委中穴可以抑制腰椎间盘细胞凋亡，有助于延缓腰椎间盘退变。

综上所述，电针委中穴可以抑制腰椎间盘退变，其机制可能是与电针委中穴抑制下游的凋亡因子Bax蛋白表达，促进抗凋亡因子Bcl-xL蛋白表达，从而有效延缓椎间盘退变相关。

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Effectsof Electroacupuncture atWeizhong on Expression of Bcl-xL and Bax in Ratswith Lumbar Disc Degeneration

HETing-chao1,CHENShao-qing1,LIN Jian-ping2,LIUWu-long1,XIAMeng1,3,WANG Shi-zhong1
1.Fujian University of TraditionalChineseMedicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;2.Fujian University of Traditional Chinese Medicine Subsidiary Rehabilitation Hospital,Fuzhou,Fujian 350003,China;3.Fujian Key Laboratory of Rehabilitation Technology,Fuzhou,Fujian 350122,China

Objective To explore the effectof electroacupuncture atWeizhong(BL40)acupointon the expression of Bcl-xL and Bax in ratswith lumbar disc degeneration.Methods Thirtymale adult Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into sham-operated group(n= 10),modelgroup(n=10),and electroacupuncture group(n=10).The lumbar disc degenerationmodelwas established by puncturing the annulus fibrosis in themodel group and electroacupuncture group.Onemonth aftermodeling,the electroacupuncture group was electroacupunctured atWeizhong acupoint for fourweeks.HE staining was used to observe the pathological changes.Immunohistochemical staining was used to observe the expression of Bax in the lumbar disc tissue.Western blotting was used to detect the expression of Bcl-xL and Bax protein.Results HE staining showed that the degrees of lumbar disc degeneration from light to severe was ranged as:the sham-operated group,the electroacupuncture group and themodel group.The expression of Bcl-xL was lower(P＜0.05),and the expression of Bax was higher(P＜0.01)in themodel group than in the sham-operated group,which was opposite(P＜0.01)in the electroacupuncture group than in themodelgroup.Conclusion Electroacuponcture atWeizhongmay upregulate the expression of Bcl-xL and downregulate the expression of Bax in ratswith lumbar disc degeneration.

lumbardisc degeneration;electroacupuncture;Weizhong;apoptosis factor;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.11.005

R681.5

A

1006-9771(2016)11-1264-05

2016-07-08

2016-09-30)

1.国家自然科学基金项目(No.81303017)；2.福建省卫生厅医学创新项目(No.2014-CXB-20)。

1.福建中医药大学，福建福州市350122；2.福建中医药大学附属康复医院，福建福州市350003；3.福建省康复技术重点实验室，福建福州市350122。作者简介：何挺超(1990-)，男，汉族，福建福清市人，硕士研究生，主要研究方向：脊柱疾病康复的临床与基础研究。通讯作者：陈少清(1983-)，男，汉族，福建漳州市人，硕士，讲师，主要研究方向：脊柱及骨关节病康复。E-mail:chenshaoqd@163.com。