MicroRNA-9调控室管膜下区干细胞增殖在电针治疗局灶性脑缺血中的作用①

黄佳，郑薏，姚建宁，叶晓倩，王露露，陶静，柳维林

MicroRNA-9调控室管膜下区干细胞增殖在电针治疗局灶性脑缺血中的作用①

黄佳，郑薏，姚建宁，叶晓倩，王露露，陶静，柳维林

目的 探讨电针曲池、足三里穴是否是通过介导m icroRNA-9(m iR-9)调控缺血再灌注损伤大鼠室管膜下区神经干细胞增殖来发挥神经保护作用。方法 52只Sprague-Daw ley大鼠随机分为假手术组(n=12)、模型组(n=12)、电针组(n=12)、电针+二甲基亚砜(DMSO)溶剂组(n=8)和电针+m iR-9模拟物组(n=8)。制作大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)致局灶性脑缺血模型，电针+DMSO溶剂组和电针+m iR-9模拟物组分别在造模前30m in侧脑室注射0.7%DMSO溶剂和m iR-9模拟物。术后第2天电针患侧曲池、足三里穴。造模后分别在第2天至第6天腹腔注射溴脱氧尿苷(BrdU)；免疫荧光观察BrdU与巢蛋白(Nestin)共定位；RT-qPCR检测室管膜下区m iR-9相对表达量。结果 电针后7 d，电针组神经缺损功能评分明显低于模型组(t=9.600,P=0.006)，脑梗死体积小于模型组(t=14.080,P=0.024)。电针组室管膜下区Nestin以及BrdU与Nestin共定位阳性细胞数量均增加，同时室管膜下区m iR-9低表达(P＜0.05)。电针+m iR-9模拟物组BrdU、Nestin阳性细胞数量以及BrdU与Nestin共定位的数量较电针+DMSO溶剂组减少。结论 电针曲池、足三里穴可促进室管膜下区神经干细胞增殖，其作用可能通过下调m iR-9表达。

局灶性脑缺血；电针；神经干细胞；microRNA-9；大鼠

[本文著录格式] 黄佳，郑薏，姚建宁，等.MicroRNA-9调控室管膜下区干细胞增殖在电针治疗局灶性脑缺血中的作用[J].中

国康复理论与实践,2016,22(11):1252-1258.

CITED AS:Huang J,Zheng Y,Yao JN,etal.EffectofmicroRNA-9 regulating stem cell proliferation in subventricular zone on electroacupuncture for focal cerebral ischemia[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(11):1252-1258.

近年来，内源性神经干细胞(neural stem cells, NSCs)的研究兴起，为针灸治疗脑卒中损伤，促进神经再生修复提出了研究假说。成年哺乳动物大脑内NSCs分布广泛，主要区域包括脑室管膜下区(subventricular zone,SVZ)、海马颗粒下层(subgranual zone, SGZ)和嗅球(olfactorius bulbus,OB)[1-2]。成年大脑内NSCs处于静息状态，在某些因素(如缺血、缺氧、炎症等)的刺激下，静息状态NSCs迅速被激活，在损伤原位出现或异位增生后，在其他趋化因子的作用下向损伤部位迁移并分化，替代并修复受损的神经元，一定程度上改善神经功能缺损[3]。

巢蛋白(Nestin)是哺乳动物NSCs中主要的细胞骨架蛋白，是一种胚胎性中间丝蛋白，在成年中枢神经系统中表达于多潜能神经前体细胞胞质中，已成为鉴定NSCs的重要标志蛋白之一。研究表明，脑缺血损伤能促使大鼠脑内Nestin阳性细胞增殖分化，参与神经再生和脑组织的功能恢复。Shimada等利用胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)纯合子转基因小鼠，在大脑中动脉闭塞(m iddle cerebral artery occlusion,MCAO)造模3 d后，发现Nestin阳性细胞显著增加，并体外证实这种细胞能够分化为神经元、少突胶质细胞[4-5]。

前期我们也证实，电针曲池、足三里能有效促进急性脑缺血大鼠模型脑内侧脑室室管膜下区内源性神经细胞增殖、迁移和分化，室管膜下区溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,BrdU)阳性细胞在7 d达到峰值，而BrdU/NeuN双阳性细胞在21 d达到峰值[6]，海马CA1、齿状回Nestin阳性细胞增加[7]，改善神经缺损功能[8-9]。但是电针具体作用机制尚未清楚。越来越多的证据也表明，非编码RNAs，包括微小RNA(m icroRNA,miRNA)参与神经保护。m iRNAs是一类序列长度约为18～25个核苷酸的非编码小RNA分子，以碱基互补配对原则识别靶向基因，抑制其翻译或直接降解mRNA。现在发现m iRNAs分子参与细胞增殖、分化以及凋亡等过程，与人类众多疾病的发生与发展密切相关[10-11]。m iR-9是一类高度保守分子，表现组织特异性，在大脑中与神经发育密切相关，它存在于NSCs上，在神经元分化时会上调[12]。

本研究试图揭示电针曲池、足三里穴是否通过介导m iR-9调控缺血再灌注损伤大鼠室管膜下区NSCs增殖。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

52只雄性Sprague-Daw ley大鼠，体质量(250±30) g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，生产许可证号SCXK(沪)2014-0002，由福建中医药大学实验动物中心喂养，许可证号SYXK(闽)2014-001。本研究由两部分实验组成。

实验1：应用随机数字表法将36只大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组，每组12只。模型组和电针组大鼠均制作局灶性脑缺血模型大鼠。电针组所有大鼠在手术后第2天取患侧曲池、足三里穴，穴位定位参考《实验针灸学》[13]。局部消毒后，用华佗牌30 号0.5寸毫针，斜刺0.2～0.3 cm，接G6805型电针仪，电压峰值6 V，以大鼠肢体轻轻抖动为度，选用疏密波，频率1～20Hz，每次30m in，每天1次，共7 d。

实验2：应用随机数字表法将16只模型大鼠随机分为电针+二甲基亚砜(DMSO)溶剂组和电针+miR-9模拟物组，每组8只。10μl 0.7%DMSO溶剂或10μl m iR-9模拟物在造模前30m in完成侧脑室注射，miR-9模拟物(10 mMol/L)溶解在0.7%DMSO中。电针+ DMSO组和电针+m iR模拟物组大鼠均接受电针患侧曲池、足三里穴治疗，其干预参数同上。

1.2 主要实验试剂

Nestin单抗、BrdU多抗：ABCAM公司。p16多抗、β-actin多抗、碱性磷酸酶标记山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗：CST公司，美国。m iR-9模拟物：SANTA CRUZ公司，美国。

1.3 局灶性脑缺血模型

实验大鼠术前24 h禁食，不禁水。采用改良Longa方法[14]，制备局灶性脑缺血动物模型。具体造模过程如下。使用10%水合氯醛0.3m l/100 g腹腔麻醉。大鼠先处于俯卧，矢状位剪开额顶部皮肤约2 cm，暴露皮下筋膜，用浸满双氧水的棉签摩擦暴露的筋膜，直至暴露出颅骨前囟及左侧半颅骨。将激光多普勒血流仪的探头固定于前囟向左5mm，向后3mm定位点上，开始记录左侧大脑中动脉供血区域血流变化值，当所示数值平稳，开始制作MCAO模型。将大鼠轻放

至仰卧位(注意探针)并固定，取颈部正中开口1.5～2 cm，暴露分离颈总动脉(common carotid artery, CCA)、颈外动脉(external carotid artery,ECA)、颈内动脉(internal carotid artery,ICA)。结扎CCA近心端及ECA，用微动脉夹夹闭远端ICA，在距CCA分叉处1.0 cm处用显微剪刀剪一切口，采用直径为0.2mm尼龙线，头端涂上硅胶，使顶端直径约0.22～0.25mm，自左侧CCA插入ICA至有少许阻力为止(自ECA与ICA分叉处起计算插入约18～22mm)，线栓到达大脑中动脉分支处，此时激光多普勒血流仪(LDF)显示血流下降至基础值的20%～30%[15]，即为栓塞成功，再固定线栓，颈部伤口缝合。待缺血2 h后回抽线栓至CCA分叉处，恢复再灌注，此时MCAO模型制备完成。假手术组只分离CCA、ICA、ECA，但不结扎、插线，稍后缝合伤口。手术结束后，所有动物放置于25℃室温环境下苏醒，保持正常饮水、饮食，直到动物恢复活动。

1.4 BrdU腹腔注射

将BrdU溶于无菌生理盐水中，终浓度为10mg/ m l，分别在手术后第2、3、4、5、6天对所有大鼠腹腔注射BrdU溶液50mg/kg，每天2次，间隔8 h，最后一次注射24 h后处死动物。

1.5 神经功能缺损评估

采用Longa[14]5分评价方法：0分，无神经功能缺损体征；1分，不能伸展对侧前爪；2分，向偏瘫侧转圈；3分，行走时向偏瘫侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。MCAO手术后2 h出现神经症状。1～3分模型鼠进入下一步实验，并电针治疗3 d和7 d后进行神经功能缺损评估。

1.6 TTC染色

大鼠乙醚麻醉后断头处死。取新鲜脑组织，用大鼠脑切片模具自距大脑额部2mm处沿冠状面切成2 mm厚的薄片，每个脑组织切成5片；进行TTC(2,3, 5-triphenyltetrazolium chloride)染色并计算脑脑梗死体积。应用Image-ProPlus图像分析处理系统(Motic Med 6.0 System)计算每片脑组织脑梗死的体积(mm3)，每个脑组织的梗死总体积由连续切割的5片脑组织的梗死体积相加所得。最后计算出梗死总体积占整个大脑体积百分比，以此结果做统计分析。

1.7 免疫组化和免疫荧光

大鼠乙醚麻醉后断头处死。取新鲜脑组织，4%多聚甲醛固定，石蜡切片。脱蜡，透明；抗原修复和DNA变性，封闭；滴加一抗Nestin(1∶150)、BrdU(1 ∶500)，置湿盒中4℃孵育过夜，PBS冲洗；滴加异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的相应二抗(1∶500)，37℃避光孵育2 h，PBS冲洗；4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diam idino-2-phenylindole, DAPI)复染；抗荧光淬灭处理及封片观察。在400×荧光显微镜下选取不重叠的6个视野，进行数据统计分析。

1.8 RT-qPCR检测

大鼠乙醚麻醉处死。取缺血侧定管膜下区，应用m iRNAA ll-in-oneTMqRT-PCRm iRNA Detection试剂盒进行逆转录反应和PCR扩增反应，miR-9引物m iRQP0825，内参U6引物RQP047936(广州复能基因公司)。反应在ABI 7500荧光定量PCR仪上完成。37℃持续60m in，85℃持续5m in进行逆转录反应；95℃预变10m in；95℃变性，20 s；60℃退火15 s，72℃延伸收集30 s，共40个扩增循环。在相对定量分析中，取同一样本目的基因的Ct值减去内参基因的Ct值，所得出的ΔCt为目的基因相对于内参基因的表达强度。再使用2-ΔΔCt方法将目的基因的表达差异通过处理样本相对于未处理样本的倍数来表示。

-ΔΔCt=-(ΔCt处理样本-ΔCt未处理样本）。

2-ΔΔCt＞1，目的基因表达上调，反之下调。该实验重复3次并取其均值。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 神经缺损功能评估

干预前，模型组与电针组神经行为学评分无显著性差异(P＞0.05)。干预7 d后，电针组神经行为学评分明显低于模型组(P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠的神经行为学评分比较

2.2脑梗死体积

假手术组脑组织染色全部为红色，其余两组脑组织冠状切面均可见不同程度的左侧梗死灶呈苍白色，与周围红色的正常脑组织界限清晰，符合血管分布范围。与模型组比较，电针组脑梗死体积减小(P＜0.05)。见图1、表2。

图1 各组TTC染色

表2 各组脑梗死体积百分比(%)

2.3 NSCs增殖

假手术组大鼠左侧大脑室管膜下区几乎无Nestin阳性细胞；模型组Nestin阳性表达显著增高；而电针组Nestin阳性表达高于模型组。见图2。

BrdU与Nestin免疫荧光共定位结果显示，与假手术组相比，模型组BrdU与Nestin共定位的细胞大量增加，并定位于缺血侧室管膜下区；电针组进一步促进大鼠室管膜下区BrdU与Nestin共定位细胞增殖。见图3。

2.4 室管膜下区m iR-9表达

以U6 snRNA作为内参，m iR-9在模型组大鼠室管膜下区的表达相对假手术组降低，而电针组表达低于模型组(P＜0.05)。电针+m iR-9模拟物组表达高于电针组(P＜0.05)，而与电针+DMSO溶剂组相比无显著性差异(P＞0.05)。见表3。

表3 各组大鼠室管膜下区m iR-9的表达水平

2.5 miR-9在NSCs增殖中的作用

电针+m iR-9模拟物组较电针+DMSO溶剂组BrdU阳性细胞数量、Nestin阳性细胞数量以及BrdU与Nestin共定位的数量相对减少。见图4。

图2 各组大鼠Nestin在室管膜下区的阳性表达(免疫组化染色，400×)

图3 假手术组、模型组、电针组BrdU与Nestin共表达(免疫荧光染色，200×)

图4 电针+miR-9模拟物组和电针+DM SO溶剂组大鼠BrdU与Nestin共表达(免疫荧光染色,200×)

3 讨论

《素问·痿论篇》提出“治痿独取阳明”。曲池、足三里均为阳明经穴。公维军等电针足三里，可有效改善脑卒中偏瘫痉挛期患者综合痉挛量表评分[16]。周海云等电针软瘫期脑卒中偏瘫患者头部运动区以及患侧肩偶、曲池、合谷、手三里、足三里、阳陵泉、三阴交等穴，有效率高于对照组[17]。本研究发现，电针曲池、足三里穴能够改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经行为学评分和脑梗死体积。

内源性NSCs是终生具有自我更新和增殖分裂能力，以维持自身数量恒定的一种细胞，对损伤具有一定反应能力和迁移功能，具有多向分化潜能，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。脑缺血损伤后，脑内室管膜下区、海马齿状回等部位NSCs被激活增殖，在损伤区趋化因子等因素刺激下迁移和分化，参与神经再生和脑组织功能的恢复[18]。Huang等证实，脑缺血损伤后激活同侧海马及室下区NSCs，且单侧脑缺血可使双侧大脑半球NSCs被激活[19]。进一步研究发现，NSCs的增殖不足以完成自身修复，超过80%新生神经元在脑卒中后6周内死亡，仅有0.2%坏死神经元被新生神经元替代[20]。本研究发现，电针曲池、足三里，可促进脑缺血后室管膜下区NSCs增殖。Kim等[21]和Cheng等[22]也发现电针能促进小鼠海马区NSCs增殖，并能改善神经缺损症状。张业贵等电针MCAO大鼠百会、大椎穴，观察到齿状回颗粒下区Nestin表达增加，7 d时达到峰值[23]。

脑缺血可诱导大鼠脑组织特异性m iRNA广泛而持续的变化。MCAO模型中，短暂脑缺血后表达发生改变的m iRNA占观察总数的20%，其中24种表达增强，23种表达减弱[24]。

m iR-9是一类高度保守分子，表现出组织特异性，在大脑中与神经发育密切相关。它存在于NSCs，在神经元分化时上调[25]。m iR-9可以表达于神经源性的大脑区域，抑制孤儿核受体Tailless样蛋白(tailless-like protein,TLX)表达，从而减少NSCs增殖及过早分化[26]。TLX则抑制m iR-9 pri-miRNA的表达。此外，m iR-9敲除后，促进胚胎干细胞中NSCs的迁移[27]。过表达m iR-9显著减少NSCs增殖并促进神经

元及星形胶质细胞的分化[28]。Jing等认为，m iR-9通过抑制Notch-1促进骨髓间充质干细胞分化为神经元[29]。脑缺血后神经祖细胞m iR-9下调，也可以调节Notch信号通路[30]。张靖慧等发现，脑缺血后7 d是NSCs增殖高峰期，此时患侧大脑组织中m iR-9表达减少；重复经颅磁刺激(repetitive transcranialmagnetic stimulation,rTMS)7 d后，m iR-9表达又显著下降，且与NSCs增殖呈负相关[31]。

本研究显示，电针曲池、足三里促进大鼠室管膜下区m iR-9低表达；侧脑室注射m iR-9激动剂阻断电针促进NSCs增殖效应。说明电针曲池、足三里可能通过下调miR-9的表达促进室管膜下区NSCs的增殖。

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Effect of MicroRNA-9 Regulating Stem Cell Proliferation in Subventricular Zone on Electroacupuncture for FocalCerebral Ischem ia

HUANG Jia,ZHENG Yi,YAO Jian-ning,YEXiao-qian,WANG Lu-lu,TAO Jing,LIUWei-lin
College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122, China

Objective To investigate theeffectof electroacupuncture(EA)atQuchi(LI11)and Zusanli(ST36)acupointson ratswith focal cerebral ischem ia,and whether itwasmediated by microRNA-9(miR-9)regulating neural stem cells proliferation in subventricular zone.Methods Fifty-two Sprague-Daw ley rats were random ly assigned into sham group(n=12),model group(n=12),EA group(n=12), EA+dimethylsulfoxide(DMSO)group(n=8)and EA+miR-9m imicsgroup(n=8).Themiddle cerebralartery occlusionmodelwas induced. DMSO and miR-9mim icswere performed by intracerebroventricular injection 30minutes beforemodeling.The EA group,EA+DMSO group and EA+m iR-9m im ics group were electroacupunctured atQuchiand Zusanliacupoints the next day aftermodeling.A ll the groups were intraperitoneally injected with bromodeoxyuridine(BrdU).The BrdU co-localized with Nestin was observed by immunofluorescence. The expression ofm iR-9 in subventricular zonewas detected by real time qPCR.Results The neurological deficitscorewas lower(t=9.600, P=0.006),and the infarctvolumewas smaller(t=14.080,P=0.024)in the electroacupuncture group than in themodelgroup.The expression of Nestin and BrdU co-localizated with Nestin increased;while the expression ofmiR-9 decreased in subventricular zone(P＜0.05)in the electoacupuncture group.However,the expression of Nestin,BrdU and BrdU co-localizated with Nestin was lower in the EA+m iR-9m imics group than in the EA+DMSO group.Conclusion Electroacupuncture atQuchiand Zusanliacupointsmay promote the neural stem cells proliferation in subventricular zoneby downregulating themiR-9 expression.

focalcerebral ischem ia;electroacupuncture;neuralstem cells;m icroRNA-9;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.11.003

R743.3

A

1006-9771(2016)11-1252-07

2016-07-01

2016-07-19)

1.福建省卫生厅青年科研课题(No.2014-1-70)；2.福建省自然科学基金(No.2016J01382)。

福建中医药大学康复医学院，福建福州市350122。作者简介：黄佳(1984-)，女，汉族，重庆市人，博士，讲师，主要研究方向：神经康复。通讯作者：柳维林(1985-)，男，汉族，湖南衡东县人，博士，讲师，主要研究方向：脑疾病中西医结合康复基础。E-mail:liu_0366@sina.com。