黄芪多糖对大鼠脊髓损伤后运动功能和脊髓病理的效果①

郑利强，伍亚民，石永江，江琼

·基础研究·

黄芪多糖对大鼠脊髓损伤后运动功能和脊髓病理的效果①

郑利强1，伍亚民2，石永江3，江琼1

目的 观察黄芪多糖对脊髓损伤后运动功能和脊髓病理变化的影响。方法 70只成年Sprague-Daw ley大鼠分为正常组(n=10)、损伤组(n=30)和治疗组(n=30)，损伤组和治疗组内再分为7 d、14 d、28 d三个亚组。损伤组和治疗组均采用A llen法(10 g×25mm)损伤大鼠T10脊髓。造模成功后，治疗组术后每天腹腔注射黄芪多糖注射液10mg/kg。术后7 d、14 d、28 d，各亚组分别行BBB评分，HE染色观察细胞形态，Nissl染色观察尼氏小体，铬花青染色观察脱髓鞘情况。结果 术后各时间点，治疗组BBB评分高于损伤组(P＜0.05)。损伤组术后7 d、14 d损伤部位以坏死组织为主，空洞开始形成；28 d时空洞基本形成，空洞周围有致密瘢痕。治疗组各时间点损伤部位坏死较轻，14 d、28 d时空洞面积缩小。损伤组术后7 d出现脱髓鞘，并逐渐加重；术后28 d，损伤中心出现空洞。治疗组各时间点脱髓鞘及髓鞘排列疏松情况有所改善。损伤组术后7 d尼氏小体开始融合，14 d时融合加重，28 d时几乎完全融合或溶解。治疗组各时间点尼氏小体融合程度较轻。结论 黄芪多糖能减轻脊髓损伤后病理损害，促进运动功能改善。

脊髓损伤；黄芪多糖；运动功能；病理；大鼠

[本文著录格式] 郑利强，伍亚民，石永江，等.黄芪多糖对大鼠脊髓损伤后运动功能和脊髓病理的效果[J].中国康复理论与实践,2016,22(11):1269-1275.

CITED AS:Zheng LQ,Wu YM,ShiYJ,etal.Effectof astragalus polysaccharide onmotor function and pathology after spinal cord injury in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(11):1269-1275.

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重致残性疾病，导致损伤平面以下感觉运动功能障碍。随着现代社会的快速发展，尤其是建筑业和交通业的发展，脊髓损伤患者数逐年呈上升趋势。

黄芪是临床上治疗神经系统疾病的常用中药之一，已经被证实有很好临床效果。黄芪多糖(astragalus polysaccharide)是黄芪的有效提取物之一，具有保护内皮细胞、抗氧化、缓解脂质过氧化反应、延缓细胞凋亡、提高机体免疫力等作用。研究显示，黄芪注射液可有效促进神经元样细胞细长突起在脑缺血组织中形成，加强网状细胞间连接，并促进其向神经元和星形胶质细胞分化[1]，对神经干细胞的增殖和分化有明显促进作用。神经干细胞可通过增殖、分化为神经元或胶质细胞，分泌多种神经营养因子及细胞外基质，促进损伤轴突再生[2-3]，有助于神经功能的恢复。本研究观察黄芪多糖对脊髓损伤后运动功能及其病理变化，为深入研究黄芪多糖对脊髓损伤治疗的临床效果提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

成年Sprague-Daw ley大鼠70只，雌性，体质量(200±20)g，由第三军医大学大坪医院动物房提供，动物生产许可证号SCXK(渝)2012-0005。分为正常组(n=10)、损伤组(n=30)和治疗组(n=30)，损伤组和治疗组内再分为7 d、14 d、28 d三个亚组。

1.2 主要试剂和仪器

黄芪多糖(质量分数≥90%)：SIGMA公司。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色、尼氏(Nissl)染液试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司。DCR-TRV318红外摄像机：SONY公司。

1.3 模型制备

大鼠称重，1%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，背部脱毛，俯卧位固定，常规消毒。以T10棘突为中心，无菌切开约2 cm，分离皮下筋膜，去除椎骨上肌肉，切开椎板，暴露T10脊髓。采用A llen打击装置，强度10 g×25mm，见大鼠双后肢回缩扑动，鼠尾痉挛性摆动，证明造模成功。逐层缝合皮肤。

术后予青霉素肌肉注射预防感染，每次1万U，每天2次，共3 d。动物置于干燥、新换垫料上，自由饮水、进食，保持适宜温度和湿度。每天挤压膀胱排尿3次，直至恢复自主排尿。

1.4 治疗方法

损伤组大鼠造模成功后不给予任何治疗，治疗组造模成功后30m in，予1mg/m l黄芪多糖10m l/kg腹腔注射，以后每天1次，直至预定时点。

1.5 评定方法

1.5.1 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分

分别于术后7 d、14 d、28 d行BBB评分。由熟悉评分标准的2名实验人员，观察动物在旷场内活动，评估其后肢功能，观察时间不少于5min。评定人员对分组情况不知情。

1.5.2 HE染色

评分结束后灌注取材，梯度脱水，OCT包埋，纵行连续冰冻切片，置于-20℃冰箱待用。

冰冻切片复温30m in，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5m in，100%乙醇1m in，95%乙醇1min，80%乙醇1m in，75%乙醇1m in，水洗2m in，苏木素染色4～5m in，分化30 s，水洗15m in，伊红染色2min，水洗，95%乙醇Ⅰ2m in，95%乙醇Ⅱ2m in，100%乙醇Ⅰ1m in，100%乙醇Ⅱ1m in，二甲苯Ⅰ透明2min，二甲苯Ⅱ透明2m in，中性树脂封片，镜下观察。

1.5.3 铬花青染色

冰冻切片60℃烤箱复温1 h，二甲苯Ⅰ透明5 m in，二甲苯Ⅱ透明5m in，无水乙醇2min，95%乙醇2m in，70%乙醇2m in，50%乙醇2m in，铬花青染色10 m in，清水2 m in，氨水分化30 s，水洗2 min，50%乙醇2m in，70%乙醇2m in，95%乙醇2m in，无水乙醇2m in，二甲苯Ⅰ透明2m in，二甲苯Ⅱ透明2 m in，中性树胶封片，镜下观察。

1.5.4 尼氏染色

上述冰冻切片70%乙醇过夜，水洗5min，焦油紫染色10m in，水洗，无水乙醇1m in，二甲苯透明5 m in，中性树脂封片，镜下观察。

1.6 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件，采用单因素方差分析。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 BBB评分

术后7 d，损伤组与治疗组大鼠BBB评分均1～3分；随后BBB评分升高。治疗组各时间点BBB评分

高于损伤组(P＜0.05)。见图1。

图1 各组BBB评分比较

2.2 HE染色

正常组脊髓细胞分布均匀，排列整齐，未见空洞及坏死组织。损伤组7 d时，脊髓损伤中心出现坏死组织，并有较小空洞形成；14 d时，损伤部位主要以坏死组织为主，较7 d时组织坏死明显加重，空洞变大；28 d时，组织坏死减少，空洞基本形成。治疗组脊髓病理变化趋势与损伤组相同，但各时间点组织坏死程度较轻，14 d、28 d空洞面积明显缩小。见图2。

2.3 铬花青染色

正常组髓鞘主要在脊髓白质中表达，分布均匀，排列紧密，未发现在灰质中表达。损伤组7 d时，损伤部位白质出现小面积脱髓鞘，且损伤周围髓鞘排列疏松，呈网状；14 d时脱髓鞘面积增大，损伤中心白质中几乎未见髓鞘，损伤周围白质中髓鞘排列疏松；28 d时脱髓鞘继续加重，有明显空洞形成。治疗组脱髓鞘变化趋势与损伤组相同，但各时间点脱髓鞘病变较轻，髓鞘排列较为紧凑。见图3。

2.4 尼氏染色

正常组尼氏小体在神经元中结构完整，单个存在。损伤组7 d，尼氏小体开始融合，14 d时融合加重，28 d时几乎完全融合或溶解。治疗组各时间点尼氏小体融合程度较轻。见图4。

3 讨论

脊髓损伤后神经功能恢复一直是医学面临的重大挑战。近年来，在不断加强对脊髓损伤功能修复实验研究的同时，国内学者开始注意采用传统中医学的理论和现代医学技术方法，探讨中医药对脊髓损伤的救治策略与措施。有研究表明，补阳还五汤可以营养神经元，促进神经修复[4]，对脊髓损伤后运动功能恢复有明显促进作用[5]。黄芪是该方的主药，我们推测黄芪在促进脊髓损伤后运动功能恢复中发挥主要作用。黄芪多糖是黄芪提取物，在保护内皮细胞、抗血小板聚集、缓解脂质过氧化反应、延缓细胞的凋亡及提高机体免疫力等方面的作用已经得到广泛认可[6-8]。

改善和促进运动功能恢复是脊髓损伤后康复的首要目标[9]。BBB评分是评价脊髓损伤后后肢运动功能恢复的行为学评分方法。本研究显示，术后7 d，损伤组与治疗组后肢运动功能恢复较慢，随后运动功能恢复较快；黄芪多糖治疗后大鼠各时间点BBB评分高于损伤组。

形态学观察显示，脊髓损伤后1周，损伤中心主要以坏死组织为主，但该阶段已经开始形成空洞，在损伤后4周空洞基本形成，且周围有胶质瘢痕形成，与既往观察结果[10]相同。黄芪多糖治疗后，组织坏死程度减轻，空洞有效面积缩小，损伤周围胶质瘢痕出现较晚，与BBB评分结果基本吻合。

脊髓损伤后功能恢复的基础是轴突通过再生，与靶细胞形成功能性突触。在特定情况下，轴突通过发芽、生长、延伸等方式与靶细胞重建联系，实现神经再支配、功能再恢复的过程。髓鞘是包裹在神经轴突外的一层膜，主要参与神经传导。髓鞘缺失可导致神经传导速度减慢，引起传导阻滞[11]。脱髓鞘病变也是脊髓损伤后重要的病理变化[12]。本研究显示，脊髓损伤大鼠出现脱髓鞘，且髓鞘排列疏松；随病程延长，损伤程度加重。黄芪多糖治疗可改善脱髓鞘状态，髓鞘排列较为紧凑。有研究表明，黄芪水溶液可防止小鼠大脑皮质和海马部位神经轴突和突触损伤[13]；黄芪提取物作为一个潜在的神经生长促进因子，可以刺激周围神经纤维跨越间隙再生，有助于周围神经轴突的再生[14]。与本研究结果相似。

图2 各组脊髓组织HE染色

图3 各组脊髓组织铬花青染色

图4 各组脊髓组织尼氏染色(1000×)

脊髓损伤后，受损部位神经元坏死，传导神经断裂，导致脊髓结构和功能发生异常。研究表明，定向诱导干细胞向神经元分化有助于脊髓损伤后神经功能恢复[15]，认为脊髓损伤后神经功能恢复主要取决于神经元。尼氏小体与神经元的功能关系密切，其数量反映神经元内蛋白的合成功能[16]；当神经元发生变性坏死时，尼氏小体体积缩小甚至消失。本研究显示，脊髓损伤后，尼氏小体融合，并逐渐加重，28 d时几乎完全融合或溶解；黄芪多糖治疗可减轻大鼠尼氏小体融合程度。既往研究表明，黄芪多糖对诱导培养的骨髓间充质干细胞有促进增殖作用[17-18]，也可以促进神经干细胞增殖和分化[19-20]；而干细胞可以增殖分化为神经元或胶质细胞，促进宿主功能部分恢复[15,21]。

总之，黄芪多糖对脊髓损伤的恢复可能有促进作用。但其作用机制尚不清楚，有待进一步研究。

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Effect of Astragalus Polysaccharide on M otor Function and Pathology after SpinalCord Injury in Rats

ZHENG Li-qiang1,WU Ya-min2,SHIYong-jiang3,JIANGQiong1
1.Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.Third Department of Research Institute of Surgery,Daping Hospital,Third Military MedicalUniversity,Chongqing 400042,China;3.Logistical Engineering University of PLAHospital,Chongqing 401331,China

Objective To observe the effectof astragalus polysaccharide onmotor function and pathology after spinal cord injury in rats. Methods Seventy adult Sprague-Daw ley ratswere selected as normal group(n=10),injury group(n=30)and treatment group(n=30),and the injury group and the treatment group were divided into 7 days,14 days,28 days subgroups.The injury group and the treatment group weremodeled with A llen'smode atT10(10 g×25mm).The treatmentgroup was injected with astragalus polysaccharide 10mg/kg per day after injury.They were rated with Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)scores 7 days,14 daysand 28 daysafter injury,while themorphology was observed with HE staining,Nylon body was observed with Nissl staining,andmyelin sheath was observed with eriochrome cyanine staining.Results The BBB scorewas significantly higher in the treatmentgroup than in the injury group ateach time point(P＜0.05).Therewas a largenumberof necrotic tissue in the injured cordsand cystic cavity began to form 7 and 14 daysafter injury.Cystic cavity formed basically and surrounded with dense scar 28 days after injury.The necrosis and cystic cavity alleviated in the treatment group ateach time point. Demyelination and myelin sheaths loosewere found 7 days after injury,and aggravated with the time.Therewas a cystic cavity in trauma center 28 days after injury.The demyelination andmyelin sheaths loose relieved ateach time point in the treatmentgroup.Nissl bodies began to coalesce 7 days after injury,and aggravated 14 days after injury,coalesced completely 28 daysafter injury.Nisslbody coalesced alleviatively in the treatmentgroup ateach time point.Conclusion Astragaluspolysaccharidemay reduce the damage and promote the recovery ofmotor function after spinal cord injury in rats.

spinal cord injury;astragalus polysaccharide;motor function;pathology;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.11.006

R651.2

A

1006-9771(2016)11-1269-07

2016-07-13

2016-08-19)

国家自然科学基金项目(No.30772299)。

1.重庆医科大学，重庆市400016；2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所三室，创伤烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆市400042；3.解放军后勤工程学院门诊部，重庆市401331。作者简介：郑利强(1987-)，男，汉族，河南焦作市人，硕士研究生，主要研究方向：神经康复。通讯作者：江琼(1964-)，女，汉族，重庆市人，硕士，副教授，主要研究方向：神经康复。E-mail:jq.ok@163.com。