电针神庭、百会对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力和海马CA1区环磷酸腺苷效应元件结合蛋白及其磷酸化水平的影响①

张蕴，林如辉，李钻芳，陶静，陈立典

·专题·

电针神庭、百会对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力和海马CA1区环磷酸腺苷效应元件结合蛋白及其磷酸化水平的影响①

张蕴1，林如辉2，李钻芳2，陶静3，陈立典4

目的 探讨电针神庭、百会治疗脑卒中后认知功能障碍的机制。方法 45只Sprague-Daw ley大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组，每组15只。后两组线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注模型。电针组于造模后24 h开始电针神庭和百会，共7 d。每天电针后行Morris水迷宫测试。治疗后，取大鼠脑组织TTC染色测量脑梗死体积，免疫组化检测海马CA1区环磷酸腺苷效应元件结合蛋白(CREB)及其磷酸化水平(p-CREB)的表达。结果 从第4天开始，与模型组相比，电针组大鼠逃避潜伏期及游泳路程缩短(P＜0.05)；穿越平台次数增多(P＜0.05)。电针组大鼠脑梗死体积小于模型组(P＜0.05)；海马CA1区CREB、p-CREB表达量较模型组增加(P＜0.05)。结论 电针神庭、百会后，脑缺血再灌注大鼠海马CA 1区CREB、p-CREB表达量增加，从而保护神经元，改善学习记忆功能。

脑缺血再灌注；学习记忆；电针；环磷酸腺苷效应元件结合蛋白；磷酸化；大鼠

[本文著录格式] 张蕴，林如辉，李钻芳，等.电针神庭、百会对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力和海马CA1区环磷酸腺苷效

应元件结合蛋白及其磷酸化水平的影响[J].中国康复理论与实践,2016,22(11):1241-1245.

CITED AS:Zhang Y,Lin RH,Li ZF,etal.Effectsof electroacupuncture at Shenting and Baihuion learning andmemory,and expression of cyclic AMP response elementbinding protein and phosphorylation in ratswith cerebral ischem ia-reperfusion[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(11):1241-1245.

卒中后认知功能障碍(post-stroke cognitiv impairment,PSCI)是脑卒中患者常见并发症[1]，且缺血性脑卒中更易导致认知功能障碍[2-3]。环磷酸腺苷效应元件结合蛋白(cyclic AMP response elementbinding protein, CREB)属于亮氨酸拉链转录因子家族，表达于各种组织，参与神经系统突触可塑性和病理生理的调节过程[4-5]，在长期记忆中起主要作用[6]，磷酸化的CREB (p-CREB)对神经元有重要的保护作用[7]，参与学习记忆过程[8-9]。本研究探讨电针干预脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力的CREB、p-CREB机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

45只成年雄性清洁级Sprague-Daw ley大鼠，体质量260～280 g，由福建中医药大学实验动物中心提供，许可证号SYXK2012-003。适应性喂养1周，自由饮食和饮水，恒温22℃，湿度50%～70%，光照8:00～20:00。

将大鼠编号，采用随机数字表法抽取对应随机数字，将随机数字由小到大进行编号，1～15号为假手术组、16～30号为模型组、31～45号为电针组。

1.2 主要仪器及试剂

华佗牌SDZ-V电针仪：苏州医疗用品厂有限公司。Morris水迷宫：中国医学科学院药物研究所。TTC：SIGMA公司。β-actin、CREB、p-CREB抗体：ABCAM公司。

1.3 模型制备

大鼠以10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉。彻底暴露颈总动脉，分离颈内动脉和颈外动脉的主干及分支，结扎颈内、颈外动脉分叉处，血管夹夹住颈内动脉分叉处，结扎颈总动脉远端，并在离结扎1～2mm处剪一小口，将线拴插入颈内动脉，松开血管夹；插入深度大约距颈内、外动脉的分叉处18～22mm，有阻塞感时停止，固定线栓。2 h后将线栓缓慢退出。

假手术组仅将动脉分离，然后缝合。

模型制备完毕后采用Longa法[10]对大鼠进行测试：0分，无神经缺失的症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向右侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，神经缺失症状严重，不能行走。0分、4分剔除，重新造模补充。

1.4 干预方法

假手术组和模型组不予任何治疗。给予同等条件喂养和抓取。

电针组选用华佗牌针灸针(直径0.25mm，长13 mm)针刺神庭、百会。大鼠穴位定位参考《实验针灸学》[11]，神庭向上斜刺，深2mm；百会向前斜刺，深2mm。接SDZ-V电针仪，疏密波，频率1～20Hz，强度2mA。每次30m in，每天1次，共1周。

1.5 Morris水迷宫

电针第2天开始进行Morris水迷宫实验，包括定位航行实验和空间探索实验。

定位航行实验时，每次训练将大鼠从4个象限依次放入，每个象限的入水点固定，间隔5min。若大鼠在90 s内找到平台，并在平台上停留3 s以上，计为逃避潜伏期；如果90 s内没有完成，则逃避潜伏期计为90 s。计算机自动计算平均路程。均取4个象限的平均值，共5 d。

空间探索实验于定位航行实验结束24 h后进行。撤掉平台，将大鼠从原平台所在象限的对面象限放入水中，计算90 s内大鼠游泳时穿过平台区的次数。

1.6 TTC染色

各组分别取7只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛3 m l/kg，左心室灌注冰生理盐水。快速断头取脑，将组织置于-20℃冰箱速冻30m in。取出组织于冰上切掉嗅球及小脑部分，在视交叉处前后每隔2mm切1片，共切5个脑片。将脑片置2%TTC溶液中，锡箔纸包裹，37℃水浴15～30m in，用毛笔刷翻动脑片，使组织均匀接触染色液[12]。Image J软件测定脑梗死面积

梗死面积=非缺血侧半球面积-缺血侧半球未梗死区面积

各脑片梗死面积之和乘以厚度为总的梗死体积，计算脑梗死灶体积与全脑体积比(脑梗死体积百分比)。

1.7 免疫组化染色

各组分别取8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛3 m l/kg，左心室生理盐水灌注冲洗，4%多聚甲醛固定。断头取脑，4%多聚甲酸后固定。梯度酒精脱

水，二甲苯透明，石蜡包埋。非连续性切片，厚5 μm。烤片，脱蜡脱水，10%H2O2室温孵育10m in，枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)高压修复抗原，滴加山羊血清抗原封闭20min，加入CREB(1∶1500)、p-CREB (1∶1000)一抗，4℃冰箱孵育过夜；滴加二抗，室温孵育20min。DAB显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水透明，封片。光学显微镜下观察。采用Image pro-Plus6.0对图片进行分析，计算平均光密度。

1.8 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行数据录入和处理。符合正态分布方差齐的组间比较采用单因素方差分析。所有数据用(±s)表示。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

从电针第4天开始，与模型组比较，电针组大鼠经过的路程、逃避潜伏期缩短(P＜0.05)；空间探索实验穿过平台次数增加(P＜0.05)。见表1、表2、表3。

表1 各组逃避潜伏期比较(s)

表2 各组经过路程比较(cm)

2.2 TTC染色

电针组梗死体积小于模型组(P＜0.05)。见图1、表4。

图1 各组脑组织TTC染色

2.3 CREB、p-CREB表达

与假手术组比较，模型组CREB、p-CREB表达减少(P＜0.05)；与模型组比较，电针组 CREB、 p-CREB表达增加(P＜0.05)。见图2、表5。

图2 各组海马CA1区CREB、p-CREB表达(免疫组化染色,bar=100μm)

表3 各组穿过平台次数比较

表4 各组梗死体积百分比比较(%)

表5 各组海马CA1区CREB、p-CREB表达比较(光密度)

3 讨论

督脉腧穴百会、神庭的下方是大脑额叶、顶叶等重要功能脑叶所在。针刺百会可以减少脑梗死体积[13]，有效缓解各种退行性疾病，改善认知功能[14]。神庭穴是元神之府中最中心的地方。二穴合用，对改善认知功能有明显作用[15]。

本研究显示，电针神庭、百会可减轻脑缺血再灌注大鼠的梗死体积，对脑组织缺血有保护作用；并能部分恢复空间学习记忆功能。

海马是缺血缺氧最敏感的区域[16]，特别是CA1区，在缺血再灌注后最易遭受二次损伤[17]。海马CA1区迟发性神经元死亡后，动物可表现出空间学习障碍[18]。它的完整性对空间学习记忆至关重要[19]。CREB作为一种记忆功能蛋白，与长时程增强记忆密切相关[20-21]，其Ser133位磷酸化对所调控的基因转录至关重要，可促进神经元存活，突触增生，神经元分化以及学习、记忆功能[22-23]。本研究显示，电针可能通过调控CREB、p-CREB的表达，保护神经元，改善缺血再灌注大鼠的学习记忆能力。

今后我们需进一步深化研究，结合相关的机制，从功能方面进行探讨，为临床应用提供依据。

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Ef fects of Electroacupuncture at Shenting and Baihuion Learning and Memory,and Expression of Cyclic AMP Response Element Binding Protein and Phosphorylation in Ratswith Cerebral Ischem ia-reperfusion

ZHANG Yun1,LINRu-hui2,LIZuan-fang2,TAO Jing3,CHEN Li-dian4
1.ClinicalMedicine Department,Fujian Health College,Fuzhou,Fujian 350101,China;2.Institute of Integrative Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;3.College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122,China;4.Fujian University of TraditionalChineseMedicine,Fuzhou,Fujian 350122,China

Objective To explore the effects of electroacupuncture at Shenting(DU24)and Baihui(DU20)on cognitive dysfunction after stroke.Methods Forty-five Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into control group(n=15),model group(n=15)and electroacupuncture group(n=15).The latter two groupswere occluded theirmiddle cerebral artery for two hours and reperfused.The electroacupuncture group accepted electroacupuncture at Shenting and Baihui24 hours aftermodeling for seven days.They were assessed with Morriswatermaze once a day since the second day of intervention.Theirbrainswere stained with TTC staining tomeasure cerebral infarction volume after treatment,while the expression of cyclic AMP response elementbinding protein(CREB)and phosphorylation(p-CREB)in hippocampal CA1 areawere detected with immunohistochem istry.Results The escape latency and sw imm ing distance of place navigation shortened in the electroacupuncture group compared with those in themodelgroup(P＜0.05)from the fourth day of intervention.The number of cross platform of spatial probe increased(P＜0.05).The infarction volumewas less in the electroacupuncture group than in themodel group(P＜0.05),with increased expression of CREB and p-CREB in hippocampalCA1 area(P＜0.05).Conclusion Electroacupuncture at Shenting and Baihui can increase the expression of CREB and phosphorylation in hippocampal CA1 area in rats after cerebral ischemia-reperfusion,to protect theneurons from ischemiaand improve the learning andmemory function.

cerebral ischem ia-reperfusion;learning and memory;electroacupuncture;cyclic AMP response element binding protein; phosphorylation;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.11.001

R743.3

A

1006-9771(2016)11-1241-05

2016-05-03

2016-07-19)

2016年福建省中青年教师教育科研项目(No.科技类JAT160802)。

1.福建卫生职业技术学院临床医学系，福建福州市350101；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州市350122；3.福建中医药大学康复医学院，福建福州市350122；4.福建中医药大学，福建福州市350122。作者简介：张蕴(1985-)，女，汉族，湖北宜昌市人，博士，讲师，主要研究方向：针刺对脑血管疾病的研究。E-mail:413295808@qq.com。