固相萃取-表面增强拉曼光谱法测定奶粉中三聚氰胺

陈小曼，雷皓宇，胡玉玲，李攻科

(中山大学 化学与化学工程学院，广东 广州 510275)



固相萃取-表面增强拉曼光谱法测定奶粉中三聚氰胺

陈小曼，雷皓宇，胡玉玲，李攻科*

(中山大学 化学与化学工程学院，广东 广州 510275)

建立了固相萃取-表面增强拉曼光谱法(SPE-SERS)测定奶粉中三聚氰胺的分析方法。待测物经乙腈提取、活性碳吸附及氢氧化钠溶液洗脱后进行SERS检测。该方法的线性范围为0.005 0～1.6 mg/L，检出限为0.100 mg/kg，回收率为75.3%～125%，相对标准偏差(RSD，n=5) 不大于9.3%。该法灵敏度高、杂质干扰小、结果准确可靠，能满足奶粉中三聚氰胺的快速检测，在奶粉质量监控方面具有良好的应用潜力。

表面增强拉曼光谱法；固相萃取；奶粉；三聚氰胺

三聚氰胺俗称密胺、蛋白精，含氮量为67%，掺入乳制品中能造成蛋白质含量达标的假象。2008年三鹿奶粉事件中，三聚氰胺造成多名婴幼儿患肾、输尿管结石病甚至肾衰竭死亡。随后政府规定婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1 mg/kg，其它食品中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg，但依然无法杜绝三聚氰胺违法添加行为。目前，三聚氰胺的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[1-2]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[3-4]、气相色谱-质谱联用法(GS-MS)[5]、比色法[6]、酶联免疫法[7]。其中，HPLC和GC-MS是国家标准方法，但存在操作复杂、分析耗时等问题，不利于现场快速检测。因此，建立一种快速有效的三聚氰胺分析方法对规范乳制品市场具有重要意义。

表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)是一种新型的光谱分析技术，有快速、高效、简单及无损分析等特点，可用于现场实时检测，已在生物检测[8-9]、食品检验[10-12]、环境监测[13-15]等领域广泛应用。Yang等[16]建立了奶粉中三聚氰胺分析的SERS法，但该法检出限为1.2 mg/kg，定量下限大于4 mg/kg，高于国家标准对婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值。Sun等[17]使用固相萃取-表面增强拉曼光谱联用技术测定农用环境水体中的水胺硫磷残留，获得了良好的结果。本文结合固相萃取和表面增强拉曼光谱法，使用乙腈提取三聚氰胺并通过活性碳吸附，氢氧化钠溶液洗脱，降低了杂质对三聚氰胺检测的影响，适用于各类奶粉中三聚氰胺含量的分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Delta Nu Inspector便携式拉曼光谱仪(美国Delta Nu)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MIULAB微型离心机(杭州米欧仪器有限公司)。

三聚氰胺(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；SERS增强试剂CP-1(厦门市普识纳米科技有限公司)；氯化钠、氢氧化钠、乙腈、盐酸、硝酸、硫酸(分析纯，广州化学试剂厂)；活性碳粉(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)；硅胶(分析纯，烟台黄务硅胶开发试验厂)；硅藻土(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)；十八烷基硅烷键合硅胶(上海博势生物科技有限公司)；标准奶粉购自广州市质量技术监督局；其他奶粉样品购自广州市海珠区某商场。

三聚氰胺标准溶液的配制：用超纯水配制浓度为500 mg/L 的三聚氰胺标准储备液，并用0.1 mol/L氢氧化钠溶液将储备液逐级稀释得到0.005 0，0.025，0.10，0.40，0.80，1.2，1.6 mg/L 的系列浓度标准溶液。

1.2 仪器分析条件

拉曼光谱仪器条件：测试模式为Soft Ware，积分时间为15 s，测定次数为5，每次测试扣除暗电流1 s，激光功率为High，结果为Average，分辨率为Low。

1.3 样品前处理

取0.1 g奶粉样品，加入10 mL乙腈，300 W下超声提取5 min，9 000 r/min下离心5 min；上清液转移至含有0.05 g活性碳粉末的离心管中，超声、离心各1 min；移除上清液并在沉淀中加入10 mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液，超声提取、离心各1 min，静置待测。移取300 μL SERS增强试剂CP-1于拉曼管中，加入50 μL待测液和7.5 μL 2 mol/L氯化钠溶液，混匀后进行SERS检测。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 提取条件优化 本实验优化了奶粉中三聚氰胺提取的超声时间和离心时间。在300 W超声功率下，超声时间分别设置为1，3，5 min。结果显示，超声5 min对应的峰信号最强。在9 000 r/min离心条件下，离心时间分别设置为1，3，5 min。结果表明，离心5 min对应的峰信号最强。继续延长超声时间至7 min和10 min，峰信号的强度基本不变，所以提取阶段超声时间和离心时间设置为5 min。

2.1.2 吸附条件优化 分别考察了活性碳、硅胶、硅藻土、十八烷基硅烷键合硅胶作为吸附剂对奶粉中三聚氰胺吸附效果的影响。结果表明，仅活性碳能吸附三聚氰胺，且吸附效果良好。Shen等[18]研究发现活性碳对三聚氰胺的吸附大致符合BET模型，吸附三聚氰胺速率的变化符合拟二级动力学模型。实验探究了活性碳用量分别为0.01，0.02，0.05 g时对三聚氰胺检测信号的影响，结果表明，当活性碳用量为0.05 g时，三聚氰胺的检测信号最强。进一步对吸附阶段的超声时间和离心时间进行优化，结果表明，当超声时间和离心时间均为1 min时，效果最好。

2.1.3 洗脱条件优化 分别考察了0.1 mol/L 盐酸、硝酸、硫酸及氢氧化钠溶液作为洗脱液时对三聚氰胺洗脱效果的影响。结果表明，当洗脱液为0.1 mol/L氢氧化钠时，洗脱效果最好。可能是因为氢氧化钠对活性碳具有腐蚀作用，在洗脱过程中将碳表面细孔体积扩大[19]，使三聚氰胺得以脱离并进入洗脱液中。本实验进一步优化了超声时间和离心时间，得到的最优时间均为1 min。

2.1.4 团聚剂用量的优化 同时使用氢氧化钠与氯化钠溶液，可大幅提高三聚氰胺的检测信号，并降低检出限[16]。以0.1 mol/L氢氧化钠溶液为洗脱液时，采用2 mol/L氯化钠溶液作团聚剂，考察了团聚剂用量分别为5，7.5，10，12.5，15，20 μL时对检测信号的影响。实验结果表明，团聚剂用量为7.5 μL时峰信号最强。

图1 三聚氰胺标准溶液的SERS图谱Fig.1 SERS spectra of melamine standard solution melamine concentration(a-h): 0,0.005,0.025,0.10,0.40,0.80,1.2,1.6 mg/L

2.2 奶粉中三聚氰胺的分析

配制浓度分别为 0.005 0，0.025，0.10，0.40，0.80，1.2，1.6 mg/L的系列三聚氰胺标准溶液，在优化条件下以1 432 cm-1处特征峰峰面积(Y)对应标准溶液浓度(X，mg/L)绘制标准曲线。结果如图1所示，三聚氰胺在0.005 0～1.6 mg/L浓度范围内具有良好的线性关系，线性方程为Y=5.774×104X+1.487×104，r2=0.997 9。以空白奶粉加标0.250 mg/kg的拉曼响应为基础，检出限(LOD)为3倍信噪比对应的浓度，则LOD为0.100 mg/kg。

2.2.2 干扰物的测定 考察了奶粉中杂质对0.05 mg/L三聚氰胺分析的干扰。以1 432 cm-1峰强度变化为评价标准，若加入干扰物后峰强无明显变化，则视为不干扰检测。由于奶粉中大多数糖类、蛋白质、有机酸及离子不溶于乙腈，主要考察了维生素C及维生素B1对检测的影响。结果表明，当维生素C和维生素B1浓度为三聚氰胺浓度的2 000倍时，1 432 cm-1处的峰面积无明显变化，表明奶粉中该类物质不干扰三聚氰胺的测定。

图2 奶粉中三聚氰胺检测的拉曼图谱Fig.2 SERS spectra of melamine detection in milk powder

2.2.3 实际样品分析 选取三聚氰胺标准奶粉进行SERS分析，三聚氰胺检测值为17.5 mg/kg，相对标准偏差(RSD)为5.2%，三聚氰胺分析的拉曼图谱如图2所示。HPLC法测定的标准值为16.2 mg/kg，RSD为0.2%，SERS法测定值与HPLC法测定值的比值为1.05，比对结果符合度良好。为了验证该分析方法在不同奶粉中的可行性，从商场中随机抽取4种类型(婴儿、学生、女士、中老年)奶粉进行SERS分析，均未发现阳性样品。以空白实际样品添加三聚氰胺进行回收率实验(见表1)，三聚氰胺的回收率为75.3%～125%，RSD(n=5)为1.3%～9.3%，数据结果表明该方法准确可靠。

表1 奶粉中三聚氰胺回收率的测定

3 结 论

本文建立了奶粉中三聚氰胺分析的固相萃取-表面增强拉曼光谱法，对标准奶粉进行了SERS分析，同时使用国家标准HPLC方法进行比对。结果表明，SERS方法定性判定与HPLC方法判定结果一致，且SERS测试结果达到HPLC方法的1.05，不存在显著差异。该法在奶粉样品中杂质去除效果良好，降低了杂质对三聚氰胺分析的干扰。相对于国家标准的HPLC及GC-MS方法，该法可大幅减少实验时间、简化实验过程、降低实验成本，具备现场快速检测能力，具有良好的应用前景。

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Determination of Melamine in Milk Powder by Solid-phase Extraction Coupled with Surface-enhanced Raman Spectroscopy

CHEN Xiao-man,LEI Hao-yu,HU Yu-ling,LI Gong-ke*

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,China )

A new analytical method was developed for the determination of melamine in milk powder by solid-phase extraction coupled with surface-enhanced Raman spectroscopy.The melamine in sample was extracted with acetonitrile,then adsorbed with activated carbon and eluted with sodium hydroxide solution.The results showed that the linear range for melamine was in the range of 0.005 0-1.6 mg/L,with a limit of detection of 0.100 mg/kg.While the method was applied in the analysis of melamine in milk powder,the recoveries for melamine were in the range of 75.3%-125%,and the relative standard deviations(n=5) were not more than 9.3%.With a remarkable effect in removing impurities,this method is accurate,reliable and sensitive in the rapid determination of melamine in milk powder,showing a great potential in monitoring the quality of milk powder.

surface-enhanced Raman spectroscopy;solid-phase extraction；milk powder；melamine

2016-05-01；

2016-05-11

国家重大科学仪器设备开发专项(2011YQ03012409)；国家自然科学基金(21575168，21277176，21475153)；广东省自然科学基金(015A030311020)；广东省公益研究与能力建设专项(2015A030401036)；广州市科技计划项目(201604020165)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.022

O657.3；TS252.51

A

1004-4957(2016)10-1343-04

*通讯作者：李攻科，教授，研究方向：色谱、光谱分析、样品前处理技术及装置研制，Tel: 020-84110922，E-mail: cesgkl@mail.sysu.edu.cn