原花青素对MSG诱导的肥胖小鼠及脂肪变性L-02肝细胞的降脂作用

曹丽娟，张旭，陈朝银，赵声兰*

（1.云南中医学院中药学院，云南昆明650500；2.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500）

原花青素对MSG诱导的肥胖小鼠及脂肪变性L-02肝细胞的降脂作用

曹丽娟1，张旭1，陈朝银2，赵声兰1*

（1.云南中医学院中药学院，云南昆明650500；2.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500）

研究原花青素对谷氨酸钠（MSG）诱导的肥胖小鼠和脂肪乳诱导的脂肪变性L-02肝细胞的降脂作用。谷氨酸钠诱导的雄性肥胖小鼠模型建立后，分为正常对照组、模型组、阳性药非诺贝特组和原花青素100 mg/kg、250 mg/kg剂量组，连续灌胃10周，测量小鼠体质量、体长、腹围，并计算李氏指数，测定血清中总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平。建立脂肪变性L-02肝细胞模型，以非诺贝特为阳性对照，给予原花青素刺激液培养24 h后，测定细胞内TG含量。结果表明，与模型组相比，原花青素100 mg/kg、250 mg/kg剂量组均能显著降低肥胖小鼠血清TC和TG水平（P＜0.05），原花青素25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL剂量组均能极显著降低脂肪变性L-02肝细胞内TG水平（P＜0.01）。

原花青素；谷氨酸钠；肥胖小鼠；脂肪变性L-02肝细胞；降脂

随着工业的快速发展和人们生活水平的不断提高，高脂血症及肥胖患病率日益增加[1-2]，同时伴随心脑血管疾病[3]、癌症[4]、糖尿病[5]等相关并发症的发生。脂代谢是人体重要的代谢过程，脂代谢紊乱既影响生活质量，又威胁身体健康。以天然植物有效成分为原料的降脂药物具有作用温和、副作用小和适合长期服用等优点，受到广大研究工作者的重视[6-7]。

原花青素（proanthocyanidin，PC）是植物中普遍存在的多酚类物质，主要由儿茶素和表儿茶素缩合而成。葡萄籽中原花青素含量达4.34%～16.86%[8-9]。原花青素具有抗氧化[10]、抗肿瘤[11]、抗紫外线[12]、抑菌[13]、降脂减肥[14]等作用，对癌症、心血管、眼科等疾病有一定治疗作用[15]。大量研究表明，中枢神经系统，尤其是下丘脑，在机体能量稳态调节中发挥重要作用，下丘脑能量调节通路结构改变或功能异常便形成下丘脑性肥胖[16]。医用脂肪乳诱导正常L-02肝细胞48 h，能够使正常L-02肝细胞发生脂肪变性成为脂肪变性L-02肝细胞，使细胞内甘油三酯蓄积和脂滴融合，引起肝细胞的脂代谢紊乱。目前，脂肪变性L-02肝细胞模型已应用于药材不同炮制品、有效部位群及单体成分的降脂活性研究[17-19]。本研究利用谷氨酸钠（monosodium glutamate，MSG）诱导的肥胖动物模型和脂肪乳诱导的脂肪变性L-02肝细胞模型，从动物水平和细胞水平研究原花青素的降脂作用，为原花青素在降脂领域的应用提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

小鼠：未有生育行为的昆明种小鼠30只（雌雄各半），体质量22 g左右（动物许可证号：SCXK（川）2013-24）；人正常L-02肝细胞株：中国科学院昆明动物研究所；谷氨酸钠：BBI生命科学有限公司；葡萄籽原花青素（纯度98%）：曲阜市圣嘉德生物科技有限公司；非诺贝特胶囊：法国利博福尼制药公司；20%医用脂肪乳：四川科伦药业股份有限公司；四季青胎牛血清（100 mL/瓶）：浙江天航生物科技有限公司；RPMI 1640培养液、甘油三酯（triglycerides，TG）测定试剂盒、总胆固醇（total cholesterol，TC）测定试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司。

1.2仪器与设备

INFINITE M200 PRO酶标仪：瑞士TECAN公司；先行者TM（OHAUS）分析天平（CP 214）：奥豪斯（上海）有限公司；MCO-20AIC CO2培养箱：日本三洋有限公司；Nikon eclipse TS 100倒置显微镜：尼康仪器（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1动物实验

MSG诱导的肥胖小鼠模型的建立：将12周龄未有生育行为的雌雄健康昆明种小鼠配对繁殖，确定雌鼠怀孕后，分出雌鼠单独喂养，每只母鼠喂养新生乳鼠10只。新生乳鼠分为MSG干预组和正常对照组。MSG干预组：乳鼠出生后第2～8天，每天皮下注射3 mg/（g·d）MSG，正常对照组给予等剂量生理盐水。正常哺乳喂养3周后，小鼠断乳喂以普通饲料，4周后雌雄小鼠分笼喂养[20]。

雄性乳鼠喂养6周龄后，将上述MSG干预组分为模型组（给予0.1 mL/10 g的生理盐水）、非诺贝特40 mg/kg剂量组、原花青素100mg/kg剂量组、原花青素250mg/kg剂量组，每组10只。正常对照组给予等剂量的生理盐水0.1 mL/10 g。试验期间，饲养环境温度为室温，各组小鼠自由进食和饮水，每天灌胃给药一次，连续10周，末次给药后禁食不禁水12 h，测量体质量和体长（鼻尖至肛门的长度），计算李氏指数，李氏指数=[体质量（g）×1 000/体长（cm）]1/3；摘眼球取血，分离血清，测定血清中甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）含量。

1.3.2细胞实验

原花青素供试品：精密称取原花青素，用稀释100倍的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）将其配制成4×10-2mg/mL的储备液，随后用G0液（仅含有0.2%血清的RPMI-1640培养液）稀释成25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL供试品。

非诺贝特阳性药：精密称取非诺贝特，用DMSO和G0液配制成质量浓度为25 μg/mL供试品。

医用脂肪乳诱导液：吸取5 mL医用脂肪乳，用10%胎牛血清稀释至100 mL。

脂肪变性L-02肝细胞模型的建立：用0.25%胰酶消化对数生长期的L-02肝细胞，计数后以每孔5×105个细胞密度接种于6孔板，放入CO2培养箱，在37℃、5%CO2及适宜湿度条件下培养，待细胞长至80%左右，用G0液进行饥饿处理24 h，使细胞周期同步化，模型组给予医用脂肪乳诱导液继续培养48 h，正常对照组给予正常培养液培养相同时间，即可得到脂肪变性L-02肝细胞。

分组及给药：实验分为正常对照组、模型组、非诺贝特组、原花青素给药组。正常对照组和模型组每孔继续给予2 mL G0液；非诺贝特组每孔给予2 mL非诺贝特供试品；原花青素给药组每孔分别给予2 mL不同质量浓度的原花青素供试品。每个浓度设3个复孔，给药后继续培养24 h。

细胞内TG含量的检测：给药培养24 h后，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤细胞2～3次，用细胞刮刀刮取细胞并收集于1.5 mL离心管，2 000 r/min离心5 min，弃上清，加入0.01%Triton X-100溶液50 μL，反复冻融3次，细胞充分裂解后，4℃，5000 r/min离心10 min，取上清，测定TG含量。

1.3.3统计学分析

实验数据用（x¯±s）表示，采用GraphPad Prism 5.0统计软件分析处理数据，所有数据进行单因素方差分析，以P＜0.05、P＜0.01为差异具有显著统计学意义。

2　结果与分析

2.1原花青素对MSG诱导的肥胖小鼠体质量、李氏指数、腹围和体长的影响

原花青素对MSG诱导的肥胖小鼠体质量、李氏指数、腹围和体长的影响结果见表1。

表1　原花青素对下丘脑性肥胖小鼠体质量、李氏指数、腹围、体长的影响Table 1 Effects of proanthocyanidins on weight,Lee’s index, abdominal circumference and body length of hypothalamic obese mice

由表1可知，与正常对照组相比，模型组体质量显著增加（P＜0.05），模型组、阳性药组、原花青素100 mg/kg剂量组和250 mg/kg剂量组小鼠的体长显著降低，腹围显著升高，李氏指数显著升高（P＜0.05），说明MSG诱导的肥胖动物模型成功建立；与模型组相比，原花青素250 mg/kg剂量组的体质量显著降低（P＜0.05），预示原花青素有一定的减肥作用。

2.2原花青素对MSG诱导的肥胖小鼠血清TG、TC的影响

图1　原花青素对下丘脑性肥胖小鼠血清中TG、TC的影响Fig.1 Effects of proanthocyanidins on the serum TG and TC in hypothalamic obese mice

原花青素对MSG诱导的肥胖小鼠血清TG、TC的影响结果见图1。由图1可知，与正常对照组相比，模型组TG和TC含量极显著性升高（P＜0.01）；与模型组相比，非诺贝特组、原花青素100 mg/kg和250 mg/kg剂量组TG和TC均显著性降低（P＜0.05），说明原花青素可降低MSG诱导的肥胖小鼠血清TG、TC水平，这与原花青素属于多酚类物质，具有较好的抗氧化活性，可能与抑制脂肪酶活性和氧化的血脂沉积在血管壁上有关[21]。在实验范围内，原花青素100 mg/kg剂量组降低肥胖小鼠血清TG、TC效果优于250 mg/kg剂量组，这与低剂量原花青素能够较好地改善肥胖模型大鼠肠道菌群结构，从而发挥较好降脂减肥作用的报道相一致[22]。50 mg/kg剂量组的降脂效果是不是更好有待进一步进行试验研究。有研究报道，苹果[23]、可可[24]、花生种皮[25]等食材中的原花青素均有降脂活性，因此食源性原花青素可作为非药物治疗高脂血症研究的一个方向。

2.3原花青素对脂肪变性L-02肝细胞中甘油三酯水平的影响

原花青素对脂肪变性肝L-02细胞中甘油三酯水平的影响结果见图2。由图2可知，与正常对照组相比，模型组TG显著性升高（P＜0.01），说明成功复制脂肪变性L-02肝细胞模型；与模型组相比，非诺贝特组和原花青素25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL剂量组均能极显著降低脂肪变性L-02肝细胞中TG水平（P＜0.01），说明原花青素对脂肪变性L-02肝细胞有降脂作用。原花青素降低脂肪变性L-02肝细胞TG的作用，在25～100 μg/mL实验范围内呈现剂量效应关系，半数有效浓度（median effective concentration，EC50）为66.26μg/mL、25μg/mL原花青素对脂肪变性L-02肝细胞的降脂作用是相同剂量非诺贝特的1.66倍，提示原花青素具有较好的降低肝脏脂肪作用。肝脏是机体代谢最旺盛的器官，是脂肪代谢的重要场所，参与脂质代谢过程的多个环节，如果脂代谢出现紊乱，则过多脂肪积累在肝脏，肝细胞内甘油三酯蓄积，发生脂肪变性，诱发脂肪肝[26-28]。

图2　原花青素对脂肪变性L-02肝细胞中甘油三酯水平的影响Fig.2 Effects of proanthocyanidins on TG content in steatosis L-02 hepatocytes

3　结论

复制MSG诱导的肥胖小鼠模型，给予肥胖小鼠原花青素10周后，原花青素给药组动物血清中TG和TC水平均显著性降低，说明原花青素对MSG诱导的肥胖小鼠具有降脂作用。复制脂肪变性L-02肝细胞模型，给予原花青素，结果表明，25～100 μg/mL原花青素能够显著降低脂肪变性L-02肝细胞内TG水平。动物实验和细胞实验结果均表明，原花青素具有良好的降脂作用。

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Lipid-lowering effect of procyanidins on the MSG-induced obese mice and steatotic L-02 hepatocytes

CAO Lijuan1,ZHANG Xu1,CHEN Chaoyin2,ZHAO Shenglan1*
(1.Faculty of Chinese Traditional Medicine,Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China; 2.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

The lipid-lowering effect of proanthocyanidins on obese mice induced by monosodium glutamate(MSG)and steatotic L-02 hepatocytes induced by fat emulsion was sudied.The MSG-induced obese mice model was established and the animals were divided into normal control group, model group,positive drug fenofibrate group,proanthocyanidins 100 mg/kg,250 mg/kg dose groups.After the obese mice were gavaged for 10 weeks,the weight,body length,.abdominal girth,Lee's indexes were measured.The contents of triglyceride,total cholesterol in serum were determined.The steatosis model of hepatocytes was established,fenofibrate was used as positive control,and the hepatocytes in the treatment groups were treated with proanthocyanidins stimulus.The intracellular triacylglycerol content was determined after 24 h.The results showed that compared with the model group,proanthocyanidins 100 mg/kg,250 mg/kg dose groups significantly reduced total cholesterol and triglyceride levels in serum of hypothalamic obese mice(P＜0.05).The proanthocyanidins 25 μg/ml,50 μg/ml,100 μg/ml dose groups significantly reduced triglyceride levels of the steatotic L-02 hepatocytes(P＜0.01).

procyanidins;MSG;obese mice;steatotic L-02 hepatocytes;lipid-lowering

TS262.9

0254-5071（2016）08-0155-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.035

2016-04-01

云南省教育厅自然科学研究重大专项（ZD2014009）；国家自然科学基金项目（21466037）

曹丽娟（1991-），女，硕士研究生，研究方向为中药资源开发与利用。

赵声兰（1962-），女，教授，硕士，研究方向为药食资源研究与开发利用。