GC-MS/MS测定镇江香醋中的氨基甲酸乙酯

唐双双，王韦岗

（镇江市产品质量监督检验中心，江苏镇江212132）

GC-MS/MS测定镇江香醋中的氨基甲酸乙酯

唐双双，王韦岗

（镇江市产品质量监督检验中心，江苏镇江212132）

镇江香醋中的氨基甲酸乙酯(EC)通过乙酸乙酯提取，用N-丙基乙二胺(PSA)分散固相萃取的方法净化，采用气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法测定。结果表明，氨基甲酸乙酯(EC)的回收率达到96.7%，标准曲线的相关系数R2为0.999 7，最低检出限为1 μg/kg。该方法简单、快速、灵敏，能有效减少杂质干扰。测定二十份不同厂家生产的镇江香醋，均检出氨基甲酸乙酯（EC）。表明镇江香醋在生产发酵过程中，不可避免的会发生EC污染，应采取措施进行控制。

镇江香醋；氨基甲酸乙酯；气相色谱-串联质谱；分散固相萃取

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是发酵食物和酒精饮品在发酵和贮存过程中天然产生的污染物，在发酵食物中广泛存在[1-2]，被国际癌症研究机构评定为2A类对人类可能的致癌物[3]，因此其对健康的影响而受到关注。醋是中国人日常生活中常用的调味品，许多人每天都会食用，而镇江香醋作为我国的四大名醋，我国食醋行业唯一的原产地保护产品，深受广大消费者青睐。现行的国家标准GB 5009.223—2014《食品中氨基甲酸乙酯的测定》[4]和中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0285—2012《出口酒中氨基甲酸乙酯残留量检测方法气相色谱-质谱法》[5]EC的检测主要是针对酒类产品和酱油，还无食醋适用的标准。作为一种重要的酿造食醋，其中不可避免的含有EC，虽然每次通过食醋摄入的含量比较低，不会对健康造成太大影响，但常年累积的总量还可能对健康构成风险，有必要对其中EC含量进行监测。

文献报道食品中EC的检测通常采用气相色谱（gas chromatography，GC）[6]、气相色谱-质谱联用（gaschromatography-mass spectrometer，GC-MS）[7-9]法和高效液相色谱-荧光检测法（high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FLD）[10]。液相色谱法需要进行衍生，而运用GC或GC-MS法进行直接检测，当遇到复杂基质的时候，干扰比较大，低浓度时的定性确证存在争议[11]，且检出限高，目标物与杂质分离度差，造成定量不准确。采用气相色谱-三重四级杆串联质谱法（gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[12]和超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法（ultra high performance liquid chromatography-electrospray tandem quadrupole mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）[13]法可以解决这类问题。

本研究采用气相色谱-三重四级杆串联质谱法（GC-MS/ MS）检测镇江香醋中的氨基甲酸乙酯，建立一种测定镇江香醋中EC的方法。通过本研究可以监测镇江香醋中EC的污染情况，帮助企业了解食品安全风险，指导消费者合理饮食，控制膳食摄入风险。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

氨基甲酸乙酯标准品（纯度＞99%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯（色谱纯）：美国TEDIA公司；氯化钠、无水硫酸钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）填料（40～60 μm，60A）：上海安谱科学仪器有限公司；镇江香醋（符合GB/T 18623—2011《地理标志产品镇江香醋》[14]标准要求）：来自不同镇江香醋生产厂家。

1.2仪器与设备

7890B/7000C三重四级杆气质联用仪：美国安捷伦公司；AL204型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TDZ5-WS台式低速自动平衡离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；HP-5016氮气吹干仪：上海济成分析仪器有限公司；WH-2涡旋混合器：南京楚强医疗器械有限公司；DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）：美国J&W Scientific公司。

1.3方法

1.3.1氨基甲酸乙酯标准曲线的制作

准确称取0.01 g（精确到0.000 1 g）氨基甲酸乙酯标准品，用甲醇溶解，定容到10 mL，配制成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液；取0.1mL储备液，用乙酸乙酯定容至100mL，配制成质量浓度为1 000 μg/L的中间液；分别吸取0.01 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.60 mL、3.20 mL中间液，用乙酸乙酯定容至10 mL，配制成质量浓度为1 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、320 μg/L的氨基甲酸乙酯标准系列溶液。

1.3.2样品前处理

称取2g镇江香醋样品放入离心管中，加入0.3g氯化钠，5mL乙酸乙酯，在涡旋混合器上混匀1min，然后4000r/min离心5 min，吸取上清液过无水硫酸钠，下层用5 mL乙酸乙酯重复提取两次，合并提取液，室温下用氮气缓缓吹至约0.5mL（不可以吹干），用乙酸乙酯定容至2mL，加入100mg PSA，漩涡混匀，离心后，取上清液供仪器分析。

1.3.3仪器分析条件

7890B/7000C三重四级杆气质联用仪，进样口温度220℃；色谱柱DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm），初始温度50℃，保持0 min，以10℃/min升至120℃，保持0 min，再以3℃/min升温至150℃，保持0 min，最后以20℃/min升至230℃，保持3min；进样量1μL；载气为高纯氦气（He），流速1 mL/min，不分流进样；接口温度250℃，离子源230℃，四级杆Ⅰ150℃，四级杆Ⅱ150℃；猝灭气（He）和碰撞气（N2）流速分别2.25 mL/min和1.5 mL/min；多反应监测（multi-reaction monitoring，MRM）模式，碰撞能20 eV，监测离子对m/z62/44（定量离子对），m/z62/44.9；电离方式：电子电离（electronionization，EI）源，电离能量70eV；溶剂延迟10min。

1.3.4定性定量方法

定性方法：以m/z 62为母离子经二次碰撞后得到的碎片离子是m/z 44、m/z 44.9，丰度比为100∶33.5。样品与标准品在相同保留时间处出峰，且对应碎片离子丰度比与标准品符合（允许±25%偏差），可定性确证为目标分析物。

定量方法：采用外标校准曲线法定量测定。以碎片离子中丰度较高的m/z44为定量离子。进样系列浓度的标准溶液，以m/z44的丰度为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标绘制标准曲线，样品中定量离子的丰度与标准曲线比较定量。

2　结果与分析

2.1碰撞能优化及标准曲线

运用单四级杆质谱得到EC的特征离子有m/z 44、62、74、89。实际样品处理后进样，m/z 44、74存在较大的基体干扰，而m/z 89丰度较低，所以选用丰度大，干扰较小的m/z 62作为母离子，进行碰撞能优化实验。取一定量标准溶液，分别在碰撞能10 eV、20 eV、30 eV、40 eV、50 eV下进样。结果如表1所示。从表1可以看出，在碰撞能为20 eV的时候，能够得到最大的丰度，碎片离子分别为m/z 44和44.9，丰度比100∶33.5。丰度大可以提高灵敏度，降低检出限，所以选用20 eV的碰撞能进行样品试验。

表1　碰撞能实验Table 1 Collision energy experiments

在上述优化条件下，将标准系列溶液依次进样，以氨基甲酸乙酯质量浓度（x）为横坐标，以定量离子m/z 44丰度（y）为纵坐标，采用外标法绘制氨基甲酸乙酯标准曲线，结果见图1，氨基甲酸乙酯标准品MRM模式下色谱图见图2。由图1可知，氨基甲酸乙酯（EC）在1～320μg/L的范围内呈良好的线性关系，其标准曲线回归方程为y=20.506x+ 19.731，相关系数为R2=0.999 7。当镇江香醋样品的取样量为2 g时，检出限可以达到1 μg/kg。

图1　氨基甲酸乙酯标准曲线Fig.1 Standard curve of ethyl carbamate

图2　氨基甲酸乙酯标准品MRM色谱图Fig.2 MRM chromatogram of ethyl carbamate standard

2.2前处理条件

镇江香醋样品基质比较复杂，要测定其中的氨基甲酸乙酯含量需要先对样品进行净化处理。多数文献采用固相萃取（solid-phase extraction，SPE）柱法进行净化[7-8，10-12]。近年来也有文献和行业标准采用基质分散固相萃取（dis persive solid phase extraction，d-SPE）的净化方法[5，9]。本实验分别比较了两种方法，固相萃取法参照GB 5009.223—2014执行。结果发现，两种方法都能达到良好的净化效果，可以有效除去醋中大量的氨基酸、有机酸和色素等成分且回收率相近。但是硅藻土固相萃取法需要使用到正己烷、乙酸乙酯、乙醚等大量有机溶剂进行洗脱，成本较高，操作步骤多。而基质分散固相萃取法简单、快速、重复性好。所以选用基质分散固相萃取法进行样品实验。

2.3回收率试验

称取氨基甲酸乙酯标准品，用蒸馏水配制成质量浓度为50 μg/mL的溶液，吸取0.1 mL样品加入到食醋样品中，使该样品的总质量为100.00 g。该样品中加标质量浓度为50 μg/kg。准确称取2.00 g样品，处理后测定，计算回收率。重复6次，得到平均回收率。结果如表2所示。由表2可知，样品的平均回收率为96.7%，在90%～110%范围内；相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.37%＜5%，表明该方法准确可靠。

表2　加标回收率试验结果Table 2 Results of addition standard recovery experiments

2.4样品的测定

选取20份不同厂家生产的镇江香醋样品进行检测，在上述气质色谱条件下，得到的阳性样品色谱图清晰，与杂质分离度良好，其中样品12的色谱图分析结果见图3。根据样品谱图、对照标准品的出峰时间及碎片离子，以m/z 44定量，m/z 44.9定性，在对应保留时间下，丰度比100∶33.5（±25%）判定为阳性样品，检测结果见表3。由表3可知，20份样品全部含有氨基甲酸乙酯，含量从21.18～73.57 μg/kg。我国目前虽然制定了酒类和酱油中EC检测的标准，但还没规定其限值。国际上多个国家已经制定了部分食品中氨基甲酸乙酯的限量标准。如加拿大规定了各类酒中的限量值，其中佐餐葡萄酒30 μg/L；美国佐餐葡萄酒15 μg/L，餐后甜葡萄酒60 μg/L。联合国粮农组织也在2002年规定饮料中氨基甲酸乙酯的含量不得超过20 μg/L。参照这些国际标准，本次实验测得镇江香醋中氨基甲酸乙酯含量都在20 μg/kg以上，表明镇江香醋中的氨基甲酸乙酯含量较高。

图3　镇江香醋样品中氨基甲酸乙酯MRM色谱图Fig.3 MRM chromatogram of ethyl carbamate in Zhenjiang vinegar samples

表3　 20份镇江香醋样品氨基甲酸乙酯含量Table 3 Ethyl carbamate content of 20 Zhenjiang vinegar samples

3　结论

本实验建立了气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）法测定镇江香醋中氨基甲酸乙酯含量的方法。该方法回收率96.7%，检出限1 μg/kg，相关系数R2为0.999 7，表明该方法能满足镇江香醋中氨基甲酸乙酯检测的需要。相比单四级杆气质联用法，该方法可以有效的减少杂质干扰，降低检出限，增加定量准确性，同时该方法也可以推广到其他酿造食醋中EC的检测，可以为标准制定提供依据。已经有研究分析黄酒等酒类中氨基甲酸乙酯的形成机理及控制方法[15-16]，而本研究中20份样品全部检出氨基甲酸乙酯，表明氨基甲酸乙酯污染在镇江香醋中普遍存在，所以下一步应在食醋当中做相应的研究，加强生产过程中的监控，规范和改善工艺条件，使该污染尽可能的维持在较低的水平。我国尚无标准规定食醋中氨基甲酸乙酯的限量，应尽快制定相应的国家标准，以标准促生产，才能更好地保护人身健康。

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Determination of ethyl carbamate in Zhenjiang vinegar by GC-MS/MS

TANG Shuangshuang,WANG Weigang
(Zhenjiang Institute of Supervision and Inspection of Product Quality,Zhenjiang 212132,China)

Ethyl carbamate(EC)in Zhenjiang vinegar was extracted by ethyl acetate,the solution was purified by primary secondary amine dispersion solid-phase extraction method,then was determined by GC-MS/MS.The results showed that the recovery rate of EC was up to 96.7%,correlation coefficientR2of standard curve was 0.999 7,the lowest limit of detection was 1 μg/kg.The method was simple,fast and sensitive,which could effectively reduce the interference of impurities.EC was detected in 20 Zhenjiang vinegar products from different manufacturers,which indicated that EC pollution was unavoidable during the process of Zhenjiang vinegar fermentation,and measures should be taken to control.

Zhenjiang vinegar;ethyl carbamate;GC-MS/MS;dispersive solid phase extraction

TS264

0254-5071（2016）08-0159-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.036

2016-03-30

唐双双（1982-），女，工程师，硕士，主要从事食品添加剂及食品中污染物检测工作。