一株产果胶酶荷叶内生真菌的分离鉴定

赵晓璐，周宁，唐咸来，谢庆武*

（1.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530004；2.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530004；3.广西壮族自治区科学技术厅，广西南宁530022）

一株产果胶酶荷叶内生真菌的分离鉴定

赵晓璐1，2，周宁1，唐咸来3，谢庆武1*

（1.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530004；2.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530004；3.广西壮族自治区科学技术厅，广西南宁530022）

以果胶为唯一碳源，通过刚果红染色法从荷叶中筛出1株产果胶酶的内生真菌HY2。根据形态学特征与ITS序列分析，将菌株HY2鉴定为炭疽菌属(Colletotrichumsp.)。该菌在28℃、150 r/min条件下发酵培养10 d，经3,5-二硝基水杨酸法(DNS)法测定发酵液中果胶酶酶活为62.9 U/mL。

荷叶；内生真菌；炭疽菌属；果胶酶

植物内生真菌是生活史的一个阶段或全部阶段生活于健康植物组织内部，不引起宿主明显病症的真菌，包括一些表生的腐生菌、潜伏性病原菌和菌根菌[1]。近年来，关于植物内生真菌代谢产物的研究日益增多。研究表明，植物内生真菌能够产生黄酮类化合物[2-3]、青蒿素[4]、紫杉醇[5-6]、生物碱[7-8]等具有多种药用功效的天然活性物质。但目前关于植物内生真菌代谢产物的研究大多局限于次级代谢产物的药用活性，鲜有关于植物内生真菌初级代谢产物果胶酶的报道。果胶酶是能够分解果胶质的多种复合酶类的总称，现已在食品、制药、生物技术等领域广泛应用，是一类重要的工业酶制剂[9]。果胶酶主要靠微生物发酵法进行工业生产，已发现有多种细菌和真菌可产果胶酶（如芽孢杆菌属[10-11]、青霉属[12-14]、曲霉属[15-16]、酵母属[17]等）。本研究采用刚果红染色法从荷叶中筛选到一株高产果胶酶的荷叶内生真菌HY2，依靠菌落形态特征、光学显微形态特征及ITS序列分析进行鉴定，并利用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosali cylic acid colorimetry，DNS）法对其发酵液的果胶酶酶活进行测定，以期为果胶酶的工业生产提供新方法和材料，丰富产果胶酶的微生物种类，也为植物内生真菌初级代谢产物的综合利用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜荷叶：广西大学校园；D-半乳糖醛酸（≥95%）：日本东京化成工业株式会社；苹果果胶（70%～75%酯化）：北京博奥拓达科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸（DNS）（≥98%）：北京索莱宝科技有限公司；氢氧化钠（≥96%）：天津博迪化工股份有限公司；酒石酸钾钠（≥99%）：成都市科龙化工试剂厂；苯酚（≥99%）：上海九邦化工有限公司；无水亚硫酸钠（≥97%）：天津达森化工产品销售有限公司；乙酸钠（≥99%）：中国医药（集团）上海化学试剂公司；刚果红（指示剂）：天津市科密欧化学试剂有限公司；GelRed：美国Biotium公司。

基础培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基[18]。

发酵培养基：果胶1%、K2HPO40.2%、FeSO40.01%、NaNO30.3%、MgSO40.05%，pH 5.0，121℃灭菌20 min。

1.2仪器与设备

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；GNP-9160型隔水式恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；EPOCH酶标仪：美国基因有限公司；ZQZC-C型振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司；Fresco 21型冷冻高速离心机：美国赛默飞世尔科技公司；SCIENTZ-48高通量组织研磨器：宁波新芝生物科技股份有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司。

1.3方法

1.3.1溶液的配制

DNS溶液：称取3.15 g 3,5-二硝基水杨酸溶于100 mL超纯水中，40℃水浴完全溶解后，依次加入10 g氢氧化钠、91 g酒石酸钾钠、2.5 g苯酚和2.5 g无水亚硫酸钠，不断搅拌至完全溶解。冷却后，用超纯水定容至500 mL，贮存于棕色瓶，放置1周后使用。

质量分数1%刚果红溶液：准确称量1.0 g刚果红，用蒸馏水溶解并定容至100 mL。

质量分数0.1%D-半乳糖醛酸溶液：准确称量0.1gD-半乳糖醛酸，用pH=5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至100 mL。

质量分数1%果胶溶液：准确称量1.0 g果胶，用pH=5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至100 mL。

1.3.2内生真菌的分离与纯化

取新鲜的荷叶叶片用清水洗净，置于净化工作台内，用无菌剪刀将叶片切成1cm×1cm的小块，首先用体积分数为75%的乙醇溶液浸泡1 min，无菌水漂洗3次，然后用质量分数为2.5%的次氯酸钠溶液浸泡4min，无菌水漂洗3次。以最后一次漂洗后的无菌水均匀涂布于基础培养基平板上，无任何菌落生长表明消毒彻底。将消毒后的叶片置于基础培养基平板上，每板放置4～5块，置于28℃培养箱内培养。每天观察，待切口处长出足量菌丝体后，依据真菌的形态特征，用接种环挑取菌丝体划线至基础培养基平板上，待长出单个菌落后，挑取单菌落多次划线后获得纯种菌体，再点接至基础培养基试管斜面上，28℃条件下培养，至菌落饱满后，依次编号，置于4℃冷冻保藏。

1.3.3产果胶酶内生真菌的筛选及粗酶液的制备

用接种环小心挑取少量纯化后菌株的菌丝体，接种至装有100mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，28℃、150r/min培养10 d后，将发酵液于4℃、4 000 r/min离心10 min，除去菌丝体后得上清液。通过刚果红染色法确定产果胶酶的内生真菌，具体操作为：取2支试管，分别加入5 mL发酵液上清液与无菌的液体发酵培养基，再加入500 μL质量分数1%刚果红溶液染色，隔天观察。果胶为多糖分子，刚果红能够与多糖分子结合形成红色复合物，当发酵培养基中的果胶被分解后，果胶含量降低，从而使染色较浅。因此能在发酵培养基内生长且刚果红染色较对照组浅，表明该菌株能够产生果胶酶分解果胶。所得上清液即为粗酶液，4℃保存备用。

1.3.4形态学鉴定

菌落形态观察：点接菌丝体于基础培养基平板上，28℃培养5 d，每天观察菌落形态。

显微形态观察：采用载玻片培养观察法观察菌丝体的显微形态特征[19]。

1.3.5总DNA的提取及ITS序列的PCR扩增

采用滤纸抽滤法获得28℃、150 r/min条件下培养5 d的菌丝体，将抽滤得到的菌丝体置于60℃干燥箱内烘干至恒质量后剪碎，置于5 mL离心管中并加入少量液氮，用研磨器研磨至粉末。采用天根试剂盒提取菌体基因组DNA。

采用真菌通用引物（ITS1和ITS4）扩增ITS序列。其中引物1：ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′），引物2：ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）反应体系：总体积50 μL；ddH2O 30 μL；5×Fast Pfu Buffer，10 μL；脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide trphosphates，dNTPs）4 μL；引物1（20 μmol/L）1 μL；引物2（20 μmol/L）1 μL；模板（总DNA）3 μL；Fast Pfu DNA聚合酶1 μL。PCR反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃总延伸5min。利用天根DNA纯化回收试剂盒（离心柱型）对PCR产物进行纯化，由华大基因测序。

1.3.6系统发育树构建

通过在线网站美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的BLAST工具，对测得的ITS拼接序列进行相似性搜索。经MEGA6.0软件选择邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树，bootstrap自检值≥50%，1 000次重复。

1.3.7果胶酶酶活测定

采用DNS法测定果胶酶活。取1.5 mL果胶溶液，50℃预热5 min。向其加入0.5 mL粗酶液，反应30 min后立即加入2.5mLDNS溶液，沸水煮3 min，立即用冰水冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL。在波长540 nm处测定吸光度值，重复3次。根据D-半乳糖醛酸标准曲线（y=1.249x-0.135 97，相关系数R2=0.999 09）计算还原糖含量。

酶活定义：在pH=5.0、反应温度50℃条件下，1 mL粗酶液分解果胶每小时产生1 mgD-半乳糖醛酸为一个酶活单位（U/mL）。

2　结果与分析

2.1产果胶酶内生真菌的筛选

依据真菌的形态特征，从新鲜健康的荷叶中分离得到5株内生真菌，分别命名为HY1、HY2、HY3、HY4和HY5。对5株内生真菌进行发酵培养后，发现菌株HY2在发酵培养基内长势良好并产生较多菌丝体，且刚果红染色后发现菌株HY2发酵液上清染色程度明显较对照组浅，表明菌株HY2能够产生果胶酶，具有降解果胶的能力。因此，以菌株HY2作为目的菌株进行深入研究。

2.2菌株形态学鉴定

将菌株HY2接种至基础培养基平板上，28℃培养5 d，观察其菌落形态和显微形态特征，结果见图1。由图1可知，菌株HY2在基础培养基平板上生长迅速，5 d后菌落直径可达6.3 cm，初生刚毛为白色，菌落圆形，边缘整齐；从菌落中央开始，刚毛混生，为绿褐色或黑色，呈毛绒状，孢子盘呈圆形，刚毛散生于孢子盘上。光学显微镜下菌株HY2菌丝体分枝不分隔，密集成栅栏状；分生孢子梗从菌丝体间生出，短，无色，有隔膜；分生孢子无色，成新月形或椭圆形，直或微弯；附着孢成黑色或黑褐色。参照《真菌鉴定手册》[20]，初步将菌株HY2鉴定为真菌界半知菌类黑盘孢目炭疽菌属。

图1　菌株HY2的菌落形态与显微形态特征(10×40)Fig.1 Colony morphology and micro-morphology characteristics of strain HY2(10×40)

2.3分子生物学鉴定

图2　菌株HY2 ITS序列的PCR扩增电泳图Fig.2 PCR amplification electrophoretogram of ITS sequence of strain HY2

选择产果胶酶内生真菌HY2进行ITS序列鉴定。采用天根试剂盒提取菌体HY2基因组DNA，进行PCR扩增，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图2。由图2可知，在500 bp附近出现了单一明亮的条带。PCR扩增产物的测序结果显示，菌株HY2的ITS序列长为574 bp。

将获得的ITS序列进行相似性检索并构建系统发育树，结果如图3所示。

图3　菌株HY2的ITS序列系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain HY2 based on ITS sequence

由图3可知，菌株HY2与炭疽菌（Colletotrichumsp. 109AC/S GenBank登录号：GU066674.1）的序列具有很高的相似性，达到99%。结合菌落形态学特征和分子生物学鉴定的结果，将荷叶内生真菌HY2鉴定为炭疽菌属（Colletotrichumsp.）。

2.4菌株HY2酶活测定结果

将菌株HY2在28℃、150 r/min条件下发酵培养10 d，获得粗酶液。采用DNS法测定粗酶液酶活，测得粗酶液中的果胶酶酶活为62.9 U/mL。白兰芳等[21]从柑橘园土样中分离获得的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）JLSP-13产果胶酶酶活最大为37.6 U/mL，王齐玮等[22]从大麻籽中筛选到7株产果胶酶的内生细菌最高酶活为21.8U/mL，表明内生真菌HY2发酵后的粗酶液具有较高的酶活，有一定应用价值。

3　结论

本研究从新鲜健康荷叶中分离得到5株内生真菌，初步发现菌株HY2在发酵培养基中生长良好，能够产生果胶酶分解利用果胶。经形态学特征和分子生物学鉴定，该菌为炭疽菌属（Colletotrichumsp.）。该菌在28℃、150 r/min条件下发酵培养10 d，测得粗酶液中果胶酶酶活为62.9 U/mL，具有较高的工业应用潜力，可以通过该菌进行果胶酶的生产。

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Isolation and identification of pectinase-producing endophytic fungus from lotus leaves

ZHAO Xiaolu1,2,ZHOU Ning1,TANG Xianlai3,XIE Qingwu1*
(1.College of Life Science and Technology,Guangxi University,Nanning 530004,China;2.State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Agricultural Bioresources in the Subtropics,Nanning 530004,China;3.The Science and Technology Department of Guangxi, Nanning 530022,China)

With pectin as the sole carbon source,a pectinase-producing endophytic fungus HY2 was screened from lotus leaves by Congo red staining method.According to morphological characteristics and ITS sequence analysis,the strain HY2 was identified asColletotrichumsp.Under the conditions of temperature 28℃,rotate speed 150 r/min and fermentation time 10 d,the pectinase activity in the fermentation liquid was 62.9 U/ml by 3,5-dinitrosalicylic acid method.

lotus leaves;endophytic fungus;Colletotrichumsp.;pectinase

Q939.9

0254-5071（2016）08-0091-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.021

2016-03-09

广西壮族自治区研究生教育创新计划项目（P3130098105）

赵晓璐（1990-），女，硕士研究生，研究方向为资源与环境微生物。

谢庆武（1959-），男，副研究员，硕士，研究方向为生物技术。