混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇的研究

吕继良，刘远芳，任潇茜，王振，周波

（1.湖北理工学院环境科学与工程学院，湖北黄石435003；2.中机国际工程设计研究院有限责任公司，江苏南京210023）

混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇的研究

吕继良1，刘远芳1，任潇茜1，王振1，周波2

（1.湖北理工学院环境科学与工程学院，湖北黄石435003；2.中机国际工程设计研究院有限责任公司，江苏南京210023）

利用不同的混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇。在初始pH值为7、降解温度为37℃的条件下，利用2 mL绿色木霉、1 mL短小芽孢杆菌和2 mL酿酒酵母降解1 g NaOH预处理稻草和10 g NaOH预处理污泥48 h，得到的乙醇产量为83.94 mg/L；在初始pH值为6、降解温度为37℃的条件下，利用3 mL绿色木霉、2 mL短小芽孢杆菌、3 mL酿酒酵母和2 mL树干毕赤酵母降解1 g NaOH预处理稻草和10 g NaOH预处理污泥48 h，得到的乙醇产量为49.29 mg/L。结果表明，绿色木霉、短小芽孢杆菌和酿酒酵母混合菌群能更有效地降解稻草和污泥转化乙醇。

稻草；污泥；混合菌群；乙醇

我国是一个农作物秸秆资源非常丰富的国家，每年的农作物秸秆产量占到了世界总秸秆的20%～30%，数量高达7亿t左右[1]。但是农作物秸秆的利用率还不到50%，剩下50%多的秸秆都被焚烧了，通过这样的方式来处理秸秆既浪费资源又污染环境[2]。农作物秸秆主要成分为纤维素、半纤维素和木质素，将农作物秸秆中的纤维素和半纤维素用来生产乙醇是解决环境污染的有效方法。由于农作物秸秆中的木质素和半纤维素对纤维素的保护作用以及纤维素本身的晶体结构特性，使农作物秸秆直接进行酶解的效率很低，所以需通过预处理来解除木质素和半纤维素对纤维素的保护作用、破坏纤维素的结晶结构、降低木质素的聚合度、增加农作物秸秆的孔隙度和表面积、增加酶与底物的接触面积、从而提高酶解的效率[3-4]。目前，微生物降解农作物秸秆的主要方法有单菌株降解和混合菌群降解。黄茜等[5]采用平菇和康氏木霉降解秸秆，研究结果表明，混合菌群降解效果远好于单菌株降解效果。李国强[6]在选用最优培养基的条件下，利用绿色木霉和康宁木霉混合菌群对玉米秸秆的降解效果好于绿色木霉和康宁木霉单独降解玉米秸秆的效果。冯玉杰等[7]利用2株纤维素降解菌和酵母菌混合菌群同时糖化发酵酸化气爆预处理后的玉米秸秆，分别对单菌株和混合菌群的玉米秸秆糖化及燃料乙醇发酵进行了研究，结果表明，混合菌群糖化效果优于单菌株糖化效果。

污泥因其有机物（蛋白质、多糖、脂类等）、营养元素（氮、磷等）含量高而受到越来越多的关注。限制污泥水解的主要因素一是污泥菌体细胞外有大量胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）的紧密包裹，二是污泥菌体细胞壁（膜）的阻隔[8-9]。污泥预处理技术不仅能促进胞外聚合物（EPS）中的大分子物质水解，而且可以打破污泥菌体细胞壁（膜），使得污泥菌体内的易降解物质释放出来，同时能将胞外难降解利用的大分子物质降解成易于被利用的小分子物质，从而增加污泥中可溶性有机物含量，提高污泥厌氧发酵的水解速率[10]。

稻草中含有大量的含碳有机物，碳氮比（C/N）较高；而污泥中含有大量的含氮物质，C/N较低。将稻草和污泥混合，可为微生物生长繁殖提供充足的C、N及其他营养成分。本研究利用绿色木霉、短小芽孢杆菌和酿酒酵母混合菌群与绿色木霉、短小芽孢杆菌、酿酒酵母和树干毕赤酵母混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇，对不同的混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇过程中影响乙醇产量的因素进行优化，并比较两种混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇的效果，为混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇的工程放大提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料

稻草：取自贵州省茅台镇附近的村庄，将取来的稻草秸秆去除其根部和穗部，风干后，用微型粉碎机粉碎至能够通过40目筛但不能通过60目筛的粉末，贮于广口瓶中备用。

污泥：取自湖北省黄石市青山湖污水处理厂脱水后的干污泥，并将取来的污泥放置于阴暗处备用。

1.1.2菌种

（1）绿色木霉（Trichoderma viride）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）：中国典型培养物保藏中心，分别可产纤维素酶和木聚糖酶。

（2）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和树干毕赤酵母（Pichia stipitis）：中国工业微生物菌种保藏中心，分别可将葡萄糖和木糖发酵为乙醇。

1.1.3培养基

（1）保藏培养基A：土豆500 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，自然pH，121℃灭菌30 min。

（2）保藏培养基B：牛肉膏3 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20 g/L，pH 7，121℃灭菌30 min。

（3）保藏培养基C：麦芽浸粉20 g/L，琼脂15 g/L，自然pH，121℃灭菌30 min。

（4）种子培养基A、B、C：分别将保藏培养基A、B、C去除琼脂，121℃灭菌30 min。

（5）降解培养基：未处理或预处理稻草若干，未处理或预处理污泥若干，调节至设定pH，121℃灭菌30 min。

1.1.4试剂

麦芽浸粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；氢氧化钠、乙醇（均为分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；浓硫酸（分析纯）：信阳市化学试剂厂；葡萄糖、重铬酸钾（均为分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；琼脂：青岛水产品加工厂；盐酸（分析纯）：中平能化集团开封东大化工有限公司。

1.2仪器与设备

FZ102微型植物粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；PHS-25pH测定仪：上海精密科学仪器有限公司；SE2001F电子天平：上海舜宇恒平科技仪器有限公司；SW-CJ-1D单人单面垂直送风净化工作台：杭州哈析仪器仪表有限公司；SPX-250生化培养箱、TS-200B气浴恒温振荡器、HH-4数显恒温水浴锅：匡贝实业（上海）有限公司；TD6M离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；UV-6100A紫外可见分光光度计：谨诚（北京）科技有限公司；XM-600烘箱：余姚市亚泰仪表有限公司；YM50立式压力蒸汽灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司。

1.3方法

1.3.1菌种的活化及种子培养基的制备

（1）菌种的活化：从保存斜面中挑取适量的绿色木霉、短小芽孢杆菌，分别在保藏培养基A、B的斜面上划线接种；从保存斜面中挑取适量的酿酒酵母和树干毕赤酵母，在保藏培养基C的斜面上划线接种；然后置于37℃的生化培养箱中培养，绿色木霉、短小芽孢杆菌、酿酒酵母和树干毕赤酵母均培养5 d后转接下一代，重复传代3次保证充分活化。

（2）种子培养基的制备：从保藏培养基A、B上分别取一环绿色木霉、短小芽孢杆菌接入100 mL种子培养基A、B中，置于30℃、150 r/min的气浴恒温振荡器中培养36 h。从酿酒酵母和树干毕赤酵母的保藏培养基C上各取一环，分别接入两个100 mL种子培养基C中，置于25℃、150 r/min的气浴恒温振荡器内培养24 h。培养后的液体种子培养基用于乙醇转化实验。

1.3.2稻草的碱预处理

称取20 g稻草粉末置于500 mL的烧杯中，按照固液比1∶20（g∶mL）加入3.5%NaOH溶液400 mL，在100℃条件下水浴加热35 min。然后用滤纸过滤，并用蒸馏水将滤饼洗涤至中性，将滤饼放在65℃条件下烘干后，用于乙醇转化实验。

1.3.3污泥的碱预处理

在250 mL锥形瓶中，加入5 g污水处理厂脱水后的干污泥，用1 mol/L NaOH溶液将污泥的pH值调节至12，然后将锥形瓶置于37℃、转速为110 r/min的气浴恒温振荡器中振荡24 h。用滤纸过滤，并用蒸馏水将滤饼洗涤至中性，将滤饼放在65℃条件下烘干后，用于乙醇转化实验。

1.3.4混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇

将绿色木霉、短小芽孢杆菌和酿酒酵母混合菌群与绿色木霉、短小芽孢杆菌、酿酒酵母和树干毕赤酵母混合菌群接入100 mL含有稻草和污泥的降解培养基中，在转速为110r/min的气浴恒温振荡器中培养一定时间后，6000r/min离心样品5 min，取上清液用于测定乙醇含量。以乙醇含量为评价指标，考察降解培养基的初始pH值及比例、接种量、降解温度、降解时间、稻草和污泥的质量比（g∶g）及预处理方法对乙醇产量的影响，并比较两种混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇的效果。

1.3.5乙醇含量的测定方法

乙醇含量的测定采用重铬酸钾比色法[11-12]。

2　结果与分析

2.1降解培养基初始pH值对乙醇产量的影响

将绿色木霉、短小芽孢杆菌和酿酒酵母各1 mL（3种菌种）种子培养基与绿色木霉、短小芽孢杆菌、酿酒酵母和树干毕赤酵母各1mL（4种菌种）种子培养基分别接入初始pH值分别为5、6、7、8、9的1 gNaOH预处理稻草和5 g NaOH预处理污泥中，置于37℃、转速为110 r/min的气浴恒温振荡器中降解36 h后取样测定乙醇产量，结果如图1所示。

图1　初始pH值对乙醇产量的影响Fig.1 Effect of initial pH on ethanol yield

由图1可知，在3种菌种的混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇的过程中，初始pH值为5～9时，乙醇产量先随着初始pH值的升高而升高；初始pH值为7时，乙醇产量达到最高值（40.49 mg/L）；初始pH值＞7之后，乙醇产量随着初始pH值的升高而降低。因此，3种菌种的混合菌群体系的最适初始pH值为7。在4种菌种的混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇的过程中，初始pH值为5～9时，乙醇产量先随着初始pH值的升高而升高；初始pH值为6时，乙醇产量达到最高值（33.62 mg/L）；初始pH值＞6之后，乙醇产量随着初始pH值的升高而降低。因此，4种菌种的混合菌群体系的最适初始pH值为6。

2.2接种体积比对乙醇产量的影响

将不同体积的绿色木霉、短小芽孢杆菌和酿酒酵母（3种菌种）种子培养基与不同体积的绿色木霉种、短小芽孢杆菌、酿酒酵母和树干毕赤酵母（4种菌种）种子培养基分别接入初始pH值为7和6的1 g NaOH预处理稻草和5 g NaOH预处理污泥中，置于37℃、转速为110 r/min的气浴恒温振荡器中降解36 h后取样测定乙醇产量，结果如图2所示。

图2　接种量对3种菌种(A)及4种菌种(B)混合发酵乙醇产量的影响Fig.2 Effect of inoculum of three strains(A)and four strains(B) mixed fermentation on ethanol yield

由图2A可知，当接入2 mL绿色木霉、1 mL短小芽胞杆菌和2 mL酿酒酵母降解稻草和污泥转化乙醇时，得到的乙醇产量最高，为45.48 mg/L。因此，绿色木霉、短小芽孢杆菌和酿酒酵母的最佳接种量分别为2 mL、1 mL和2 mL。由图2B可知，当接入3mL绿色木霉、2mL短小芽胞杆菌、3 mL酿酒酵母和2 mL树干毕赤酵母降解稻草和污泥转化乙醇时，得到的乙醇含量最高，为34.59 mg/L。因此，绿色木霉、短小芽孢杆菌、酿酒酵母和树干毕赤酵母的最佳接种量分别为3 mL、2 mL、3 mL和2 mL。

2.3稻草和污泥质量比对乙醇产量的影响

图3　稻草和污泥质量比对乙醇产量的影响Fig.3 Effect of mass ratio of rice straw and sludge on ethanol yield

将2 mL绿色木霉、1 mL短小芽孢杆菌和2 mL酿酒酵母（3种菌种）种子培养基与3 mL绿色木霉、2 mL短小芽孢杆菌、3 mL酿酒酵母和2 mL树干毕赤酵母（4种菌种）种子培养基分别接入初始pH值为7和6的不同质量比（1∶1、1∶5、1∶10、2∶5、3∶5）的NaOH预处理稻草和NaOH预处理污泥中，置于37℃、转速为110 r/min的气浴恒温振荡器中降解36 h后取样测定乙醇产量，结果如图3所示。

较高的底物质量浓度有助于提高产物的乙醇产量，从而降低乙醇蒸馏回收所耗用的能量成本[13]；但较高含量乙醇对反应体系中的纤维素酶和发酵菌株会产生反馈抑制作用，导致乙醇产量降低。因此，为了能够更加高效地利用纤维素，同时又尽可能获得较高乙醇产量，有必要对底物质量浓度进行优化[14]。由图3可知，两种混合菌群体系均在稻草和污泥质量比为1∶10时，得到最高乙醇产量分别为76.06 mg/L和45.95 mg/L，因为1 g稻草和10 g污泥混合后，得到适合微生物生长的C/N，从而促进微生物生长繁殖，所以能得到较高的乙醇产量。因此，两种混合菌群体系的最佳稻草和污泥质量比均为1∶10。

2.4稻草和污泥预处理方法对乙醇产量的影响

取1 g未处理稻草和10 g未处理污泥（均未预处理）、1 g NaOH预处理稻草和10 g未处理污泥（稻预）、1 g未处理稻草和10gNaOH预处理污泥（污预）、1gNaOH预处理稻草和10 g NaOH预处理污泥（均预处理），按照上述两种混合菌群体系的最佳条件，置于37℃、转速为110r/min的气浴恒温振荡器中降解36 h后取样测定乙醇产量，结果如图4所示。

图4　稻草和污泥预处理方法对乙醇产量的影响Fig.4 Effect of pretreatment methods of rice straw and sludge on ethanol yield

由图4可知，两种混合菌群体系均在预处理稻草和污泥时得到较高的乙醇产量。因为NaOH处理稻草可以破坏木质素的空间结构，其机理在于氢氧根离子能够削弱纤维素和半纤维素之间的氢键并且皂化半纤维素和木质素分子之间的酯键；碱性的氢氧化钠对稻草分子之间相互交联的木聚糖、半纤维素和其他组分的酯键也有皂化作用，使酯键减少，稻草的孔隙率增加，可使纤维素的降解率大大提高[15-16]。利用NaOH预处理污泥，NaOH可与污泥菌体细胞壁（膜）上的脂类发生皂化反应，破坏细胞膜、释放大量的有机物，从而加快污泥胞外聚合物及胞内大分子物质的水解，从而增强污泥中有机物的利用率[17，10]。两种混合菌群体系得到的乙醇最高产量分别为76.06 mg/L和45.95 mg/L。因此，选择稻草和污泥均进行预处理的方法。

2.5降解温度对乙醇产量的影响

按照上述两种混合菌群体系的最佳条件，分别置于不同的温度（27℃、32℃、37℃、42℃、47℃）、转速为110 r/min的气浴恒温振荡器中降解36 h后取样测定乙醇产量，结果如图5所示。

图5　降解温度对乙醇产量的影响Fig.5 Effect of degradation temperature on ethanol yield

由图5可知，在两种混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇的过程中，降解温度为27～47℃时，乙醇产量先随着降解温度的升高而升高；降解温度为37℃时，乙醇产量达到最高值（分别为76.06 mg/L和45.95 mg/L）；降解温度＞37℃之后，乙醇产量随着降解温度的升高而降低，由于温度较高，绿色木霉和短小芽孢杆菌分别产的纤维素酶和木聚糖酶活性不高，致使纤维素和半纤维素酶解速率降低，从而限制了降解过程。因此，两种混合菌群体系的最适降解温度均为37℃。

2.6降解时间对乙醇产量的影响

按照上述两种混合菌群体系的最佳条件，分别置于37℃、转速为110 r/min的气浴恒温振荡器中降解不同时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h）后取样测定乙醇产量，结果如图6所示。

图6　降解时间对乙醇产量的影响Fig.6 Effect of degradation time on ethanol yield

由图6可知，在3种菌种的混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇的过程中，降解时间为12～24 h时，乙醇产量基本没变化，因为绿色木霉、短小芽孢杆菌和酿酒酵母混合菌群处于适应期；降解时间为24～48 h时，乙醇产量随着降解时间的增加而升高，并在降解时间为48 h时，乙醇产量达到最高值（83.94 mg/L）；降解时间＞48 h之后，乙醇产量随着降解时间的增加而降低。因此，3种菌种的混合菌群体系的最佳降解时间为48 h。

在4种菌种的混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇的过程中，降解时间为12～24 h时，乙醇产量随着降解时间的增加而降低，因为绿色木霉和短小芽孢杆菌降解稻草和污泥得到的部分葡萄糖被混合菌群用于自身的代谢，导致转化成乙醇的葡萄糖减少，致使乙醇产量降低；降解时间为24～48h时，乙醇产量随着降解时间的增加而升高，并在降解时间为48 h时，乙醇产量达到最高值（49.29 mg/L）；降解时间＞48 h之后，乙醇产量随着降解时间的增加稍有降低。因此，4种菌种的混合菌群体系的最佳降解时间为48 h。

在降解时间为48 h时，3种菌种的混合菌群体系比4种菌种的混合菌群体系得到的乙醇产量高。因为NaOH预处理稻草中纤维素和半纤维素分别在绿色木霉产的纤维素酶和短小芽孢杆菌产的木聚糖酶的作用下转化成葡萄糖和木糖，而NaOH预处理稻草中的纤维素含量高于半纤维素含量，所以得到的葡萄糖含量高于木糖含量。葡萄糖是单糖，较纤维素和半纤维素，更容易被微生物利用。在3种菌种的混合菌群体系中，混合菌群用于自身代谢的葡萄糖较少，大部分的葡萄糖被酿酒酵母转化成了乙醇；而在4种菌种的混合菌群体系中，混合菌群用于自身代谢的葡萄糖较多，只有很少一部分葡萄糖被酿酒酵母转化成了乙醇，虽然树干毕赤酵母可将木糖转化成乙醇，但木糖含量比葡萄糖含量低很多，所以4种菌种的混合菌群体系最终得到的乙醇产量仍然比3种菌种的混合菌群体系得到的乙醇产量低。

3　结论

利用绿色木霉、短小芽孢杆菌和酿酒酵母混合菌群与绿色木霉、短小芽孢杆菌、酿酒酵母和树干毕赤酵母混合菌群降解稻草和污泥转化乙醇。结果表明，在初始pH值为7、降解温度为37℃的条件下，利用2 mL绿色木霉、1 mL短小芽孢杆菌和2 mL酿酒酵母降解1 g NaOH预处理稻草和10gNaOH预处理污泥48 h，得到的乙醇产量为83.94 mg/L。因此，绿色木霉、短小芽孢杆菌和酿酒酵母混合菌群能有效地降解稻草和污泥转化乙醇。

[1]赵红霞，詹勇，杨建军.白腐真菌降解秸秆作物研究及应用[J].中国饲料，2003，15（3）：25-27.

[2]李春凤.漆酶高产菌株选育及其降解秸秆木质素机理研究[D].合肥：安徽农业大学，2009.

[3]张振，臧中盛，刘苹，等.木质纤维素预处理方法的研究进展[J].湖北农业科学，2012，51（7）：1306-1308.

[4]王新明，肖林，杨建，等.纤维素乙醇发酵方法及发酵抑制[J].中国酿造，2013，21（S1）：8-11.

[5]黄茜，黄凤洪，江木兰，等.木质素降解菌的筛选及混合菌发酵降解秸秆的研究[J].中国生物工程杂志，2008，28（2）：66-70.

[6]李国强.两种木霉混合菌产酶的条件优化及其对玉米秸秆降解的研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2011.

[7]冯玉杰，李冬梅，任南琪.混合菌群用于纤维素糖化和燃料酒精发酵的试验研究[J].太阳能学报，2007，2（4）：375-379.

[8]DEWI R,APPELS L,BAEYENS J,et al.Peroxidation enhances the biogasproductionintheanaerobicdigestionofbiosolids[J].J Hazard Mater, 2007,146(3)：577-581.

[9]戴前进，李艺，方先金.城市污水处理厂剩余污泥厌氧消化试验研究[J].中国给水排水，2006，22（23）：95-98.

[10]张万钦，戚丹丹，吴树彪，等.不同预处理方式对污泥厌氧发酵的影响[J].农业机械学报，2014，45（9）：187-198.

[11]牟建楼，王颉，张伟，等.乙醇的测定方法综述[J].酿酒，2006，33（2）：46-48.

[12]刘薇.构建混合微生物菌群降解稻草生成乙醇的研究[D].南昌：南昌大学，2010.

[13]RUDOLFA,ALKASRSWI M,ZACCHI G,et al.A comparison between batch and fed-batch simultaneous saccharification and fermentation of steam pretreated spruce[J].Enzyme Microb Tech,2005,37(2)：195-204.

[14]YANG S,DING W Y,CHEN H Z.Enzymatic hydrolysis of corn stalk on a hollow fiber ultra filtration membrane reactor[J].Biomass Bioenerg,2009,33(2)：332-336.

[15]王健，袁勇俊，张弛松.纤维素发酵生产酒精研究进展[J].中国酿造，2006，25（6）：9-13.

[16]朱跃钊，卢定强，万红贵，等.木质纤维素预处理技术研究进展[J].生物加工过程，2004，2（4）：11-16.

[17]KOTAY S M,DAS D.Novel dark fermentation involving bioaugmentation with constructed bacterial consortium for enhanced biohydrogen production from pretreated sewage sludge[J].Int J Hydrogen Energ, 2009,34(17)：7489-7496.

Degradation of rice straw and sludge into ethanol by multi-specise culture

LÜ Jiliang1,LIU Yuanfang1,REN Xiaoqian1,WANG Zhen1,ZHOU Bo2
(1.School of Environmental Science and Engineering,Hubei Polytechnic University,Huangshi 435003,China; 2.China Machinery International Engineering Design&Research Institute Co.,Ltd.,Nanjing 210023,China)

Ethanol was produced by degradation of rice straw and sludge with multi-specise culture.Under the condition of initial pH 7 and degradation temperature 37℃,the 1 g NaOH pretreated rice straw and 10 g NaOH pretreated sludge were degraded by 2 mlTrichoderma viride,1 mlBacillus pumilusand 2 mlSaccharomyces cerevisiaefor 48 h,and the yield of ethanol was 83.94 mg/L.Under the condition of initial pH 6 and degradation temperature 37℃,the 1 g NaOH pretreated rice straw and 10 g NaOH pretreated sludge were degraded by 3 mlT.viride,2 mlB.pumilus,3 ml S.cerevisiaeand 2 mlPichia stipitisfor 48 h,and the yield of ethanol was 49.29 mg/L.The results showed that the multi-specise culture composed of T.viride,B.pumilusandS.cerevisiaecould more effectively degrade rice straw and sludge into ethanol.

rice straw;sludge;multi-specise culture;ethanol

X705

0254-5071（2016）08-0095-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.022

2016-03-16

湖北省自然科学基金项目（2014CFB183）；湖北理工学院校级引进人才科研项目（13xjz05R）

吕继良（1982-），男，讲师，博士，研究方向为生物质能源转化。