大秃马勃菌丝体多糖的发酵条件优化及其抑菌作用

李作美，吴珊珊，陈佳

（蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233000）

大秃马勃菌丝体多糖的发酵条件优化及其抑菌作用

李作美，吴珊珊，陈佳

（蚌埠学院生物与食品工程系，安徽蚌埠233000）

采用单因素试验及正交试验对大秃马勃菌丝体多糖的液态发酵条件进行了优化。以细菌作为供试菌种，采用滤纸片法对提取的大秃马勃菌丝体多糖进行了抑菌实验。结果表明，大马勃液态发酵培养的最佳条件为发酵温度28℃，转速150 r/min，发酵时间8 d。在此最佳发酵条件下，菌体干质量为（7.08±0.51）g/L。抑菌实验结果显示，大秃马勃菌丝体多糖对革兰氏阳性菌有明显地抑制作用，并且随着多糖质量浓度的增大，抑菌作用越强。

大秃马勃菌丝体；多糖；液态发酵；抑菌作用

大秃马勃菌（Calvatia gigantea）又名灰包、马粪包，隶属于担子菌门（Basidiomycota）、伞菌科（Agaricaceae），广泛分布于世界各地。在中国主要产于内蒙古、辽宁、安徽、甘肃、江苏、云南等省区[1]。大秃马勃菌是食药用的大型真菌，幼时可以食用，但主要是用作清热解毒的药品，其主要有抑菌[2]、止血[3]、杀虫[4]、抗肿瘤[5]、消肿、解毒[6-7]、清肺、镇痛、抗炎[8-10]、治咳嗽[11]等作用。大秃马勃菌的药用功能主要是因为其含有丰富的生物活性物质，其含有多种氨基酸、麦角甾醇、类脂质、马勃素、抗坏血酸、无机盐和金属离子等。大秃马勃菌的食用和药用性国内外文献均有记载。近代学者研究表明，大秃马勃菌作为一种中药材，在临床上已经广泛应用，并且取得了显著的疗效，具有良好的发展前景。但由于大秃马勃子实体的生长受到环境条件制约，产量有限。本试验采用液态发酵法制备大秃马勃菌丝体，用水提醇沉法提取大秃马勃菌丝体粗多糖（Calvatia giganteapolysaccharides，CGP），并研究其抑菌作用，通过滤纸片法测定抑菌圈的大小来考察大秃马勃多糖对细菌的抑菌能力，以便为今后更好地研究大秃马勃菌丝体粗多糖的药用功能提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株

大秃马勃菌（Calvatia gigantean）：广东省微生物菌种保藏中心；枯草杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、变形杆菌（Proteus vulgare）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：均由蚌埠学院生物与食品工程系微生物学实验室提供。

1.1.2化学试剂

蛋白胨、葡萄糖、硫胺素、磷酸二氢钾、硫酸镁、牛肉膏、氯化钠、琼脂、硫酸、苯酚等（均为分析纯）：南京博岸生物科技有限公司。

1.1.3培养基

斜面培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

发酵培养基：20%马铃薯汁1 L，葡萄糖20 g/L，磷酸二氢钾3 g/L，硫酸镁1.5 g/L，硫胺素8 mg/L，蛋白胨1 g/L，pH 5.6。灭菌温度121℃，时间20 min。

20%马铃薯汁配制：新鲜马铃薯进行去皮称质量200 g，切成小块煮沸20 min，然后过滤，滤去土豆渣，滤液不足1 000 mL时用水补足。

1.2仪器与设备

LGJ-15D冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；FA214电子分析天平、YXQ-LS-5011立式蒸汽压力灭菌锅、7HZ-103B恒温摇床：博讯实业有限公司医疗设备厂；TGL-16G低速离心机：上海安亭科学仪器厂；RE-2000旋转蒸发器：予华仪器有限责任公司；HH-4数显恒温水浴锅：金坛市荣华仪器制造公司。

1.3实验方法

1.3.1大秃马勃菌菌种活化

将大秃马勃菌种接入到固体斜面培养基中，放置在28℃恒温培养箱中培养48 h进行菌种的活化。

1.3.2大秃马勃菌种子悬浮液的制备

将活化的大秃马勃菌种接入液体培养基中，放置摇床中进行培养，然后用吸管吸取1 mL已活化好的菌液放入9 mL无菌生理盐水中，振荡摇匀，制成菌悬液，备用。

1.3.3大秃马勃菌丝体粗多糖的制备工艺流程[12]

大秃马勃菌→摇瓶培养→过滤→菌丝体水洗→60℃烘干→粉碎→热水浸提→2 000 r/min离心10 min→收集上清液→真空浓缩→乙醇醇沉→2 000 r/min离心10 min→蒸馏水复溶→透析→冷冻干燥→粗多糖

操作要点：

摇瓶培养：在大秃马勃菌装液量为180 mL/250 mL、摇床转速为150 r/min时，培养温度为28℃，培养时间为8 d，接种量为20%的条件下进行培养，得到大秃马勃菌丝体。

过滤：采用四层纱布对大秃马勃菌丝体进行过滤，去滤液。

烘干：滤渣在60℃条件下真空干燥。

粉碎：粉碎过100目筛。

热水浸提：浸提温度为80℃，浸提时间为5 h，液料比为20∶1（mL∶g）。

真空浓缩：真空浓缩温度为60℃，浓缩液呈现黏稠状为止。

乙醇醇沉：乙醇体积分数为95%、加入量为浓缩液的2倍、醇沉时间为24 h。

透析：透析袋截留分子质量为14 000 u，采用去离子水进行透析，透析时间为48 h，每8 h更换一次去离子水。

冷冻干燥：温度为-80℃，时间为3 d。

1.3.4发酵条件优化的单因素试验

在发酵温度分别为22℃、25℃、28℃、31℃、35℃，接种量分别为5%、10%、15%、20%、25%，发酵时间分别为2 d、4 d、6 d、8 d、10 d，装液量为180 mL/250 mL，摇床转速为150 r/min条件下进行发酵试验，考察发酵温度、接种量及发酵时间对菌丝体干质量的影响。

1.3.5发酵条件优化试验

在单因素试验基础上，以菌丝体干质量为评价指标，发酵温度（A）、发酵时间（B）及接种量（C）为影响因素进行正交试验，其因素和水平见表1。

表1　发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.6多糖含量的测定

采用硫酸-苯酚法[13]测定样品中多糖含量。葡萄糖标准曲线的制作：精确称取烘干至恒质量的葡萄糖0.100 g，加适量蒸馏水溶解，转移至1 000 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。分别精确吸取葡萄糖标准溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL置于试管中，加水至2.0 mL，再分别加入6%苯酚溶液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，静置10 min后摇匀，在室温条件下显色30 min，以蒸馏水为参比，在波长490 nm处测定吸光度值。按照葡萄糖标准曲线回归方程计算样品中多糖含量。

1.3.7大秃马勃菌多糖的抑菌性实验

（1）活化供试菌种和制备菌悬液[14]

将4种供试菌种（枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及变形杆菌）接入到试管斜面进行活化，活化温度为37℃，活化时间为24 h。然后将活化后的菌种分别接入液态培养基中，放入转速为150 r/min的摇床进行培养。将培养后的4种供试菌分别用吸液管吸取1 mL菌液于三角瓶里，再用吸液管吸取9 mL无菌生理盐水于菌液中，轻轻振荡并摇均，制成菌悬液，浓度约为103～104CFU/mL，备用。

（2）抑菌实验的设计

滤纸片法测定抑菌作用[14]。用打孔机将圆形滤纸片进行打孔，直径为6 mm，然后取直径为6 mm的圆形滤纸片于高压灭菌锅中进行湿热灭菌，备用。按10倍稀释法用蒸馏水将大秃马勃菌多糖溶液分别稀释为3个梯度，质量浓度分别为0.1 mg/mL、0.01 mg/mL及0.001 mg/mL。将滤纸片放入大秃马勃菌多糖溶液中浸泡3 min。分别倒入15 mL已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基于培养皿中，待培养基凝固后，从已活化好的供试菌液分别用吸管吸取0.1 mL，均匀的涂布在培养基的表面，再取出浸泡在不同质量浓度的大秃马勃菌多糖溶液中的滤纸片并将其按一定的距离贴在平板上，将每个固体培养皿上贴3片，平均分布，每种菌种都要做3个平行试验，采用浸泡在无菌水中的滤纸片作空白对照。再将制好的各培养皿放入温度为37℃生化培养箱培养24 h[15]。观察并测定抑菌圈直径的大小，通过测定抑菌圈的大小来考察抑菌效果。

2　结果与分析

2.1发酵条件优化单因素试验

2.1.1培养温度对大秃马勃菌丝体干质量的影响

考察不同发酵温度（22℃、25℃、28℃、31℃、34℃）对大秃马勃菌丝体干质量的影响，结果见图1。由图1可知，发酵温度为22～25℃时，为了适应新的培养条件，大秃马勃菌丝体干质量呈现缓慢增长的趋势；发酵温度为28℃时，大秃马勃菌丝体的生长最快，菌丝体干质量达到最高（6.98±0.51）g/L；发酵温度＞28℃之后，菌丝体干质量逐渐减少。因此，选择发酵温度为28℃。

图1　发酵温度对大秃马勃菌丝体产量的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature onCalvatia gigantea mycelia production

2.1.2发酵时间对大秃马勃菌丝体干质量的影响

图2　发酵时间对大秃马勃菌丝体产量的影响Fig.2 Effect of fermentation time onCalvatia gigantea mycelia production

考察不同发酵时间（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d）对大秃马勃菌丝体干质量的影响，结果见图2。由图2可知，发酵时间为2～4 d，菌丝体缓慢生长；发酵时间为4～6 d，菌丝体快速生长；发酵时间第8天时，菌丝体干质量达最大值（6.91±0.54）g/L；发酵时间＞8 d之后，菌丝体产量有所减少，可能是菌丝体开始出现自溶或是衰亡的现象造成的。因此，选择发酵时间为8 d。

2.1.3接种量对大秃马勃菌丝体干质量的影响

考察不同接种量（5%、10%、15%、20%、25%）对大秃马勃菌丝体干质量的影响，结果见图3。由图3可知，接种量为5%～20%时，菌丝体干质量随接种量增加而增加；接种量为20%时，菌丝体干质量达最大值（7.18±0.48）g/L；接种量＞20%之后，培养液的营养不足，菌丝体不能很好生长，菌丝体干质量有所下降。因此，选择接种量为20%。

图3　接种量对大秃马勃菌丝体产量的影响Fig.3 Effect of inoculum onCalvatia giganteamycelia production

2.2多糖含量的测定

以葡萄糖质量浓度（x，μg/mL）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线[16]，结果见图4。由图4可知，葡萄糖标准曲线的回归方程为y=0.004 3x-0.003 0，相关系数R2为0.998 7，表明二者线性关系良好。样液的吸光度值代入到回归方程中进行计算，即可得到样液中多糖的含量。

图4　葡萄糖标准曲线Fig.4 Standard curve of glucose

2.3发酵条件优化正交试验

在单因素试验基础上，选择发酵温度（A）、发酵时间（B）、接种量（C）为影响因子，以菌丝体干质量为评价指标，进行L9（33）正交试验，结果与分析见表2。

表2　发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

由表2可知，影响菌丝体干质量的顺序为发酵温度（A）＞发酵时间（B）＞接种量（C），最佳发酵条件组合A2B2C2，即发酵温度为28℃、发酵时间为8 d、接种量为20%。在此最佳发酵条件下，菌丝体干质量为（7.08±0.51）g/L。

2.4 CGP抑菌实验结果分析

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌及枯草杆菌接种到平板上，在37℃培养24 h。考察大秃马勃菌多糖溶液质量浓度分别为0.1 mg/mL和0.01 mg/mL及0.001 mg/mL对4种细菌的抑菌效果，结果见表3。

表3　大秃马勃菌丝体多糖抑菌效果Table 3 Antibacterial effect ofCalvatia giganteamycelia polysaccharidesmm

由表3可知，大秃马勃菌多糖对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及变形杆菌均有一定的抑菌效果，而且对枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果要比大肠杆菌和变形杆菌要强。在大秃马勃菌多糖溶液为0.001mg/mL时，大肠杆菌和变形杆菌的抑菌圈平均直径分别为6.64 mm和7.13 mm，而枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均直径分别为9.21mm和9.97mm。而只有在抑菌圈直径＞6 mm时才有抑菌效果。在大秃马勃多糖溶液在0.1 mg/mL时，革兰氏阴性菌大肠杆菌和变形杆菌的抑菌圈的平均直径分别为8.55 mm和9.03 mm。而革兰氏阳性菌枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈的平均直径分别为12.94 mm和13.56mm。由此可见，大秃马勃菌多糖抑菌活性的强弱与多糖质量浓度呈现一定的量效关系。

3　结论

结果表明，大秃马勃菌在装液量为180 mL/250 mL、摇床转速为150 r/min时，大秃马勃液体发酵的最佳的培养条件为发酵温度28℃，发酵时间8 d，接种量20%。在此最佳发酵条件下，菌丝体干质量为（7.08±0.51）g/L。抑菌实验结果表明：大秃马勃菌多糖对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌抑菌效果要强于大肠杆菌和变形杆菌，大秃马勃多糖对革兰氏阳性菌的抑制作用要大于革兰氏阴性菌，并且呈现出一定的量效关系。

[1]游洋，包海鹰.不同成熟期大秃马勃子实体提取物的抑菌活性及其挥发油成分分析[J].菌物学报，2011，30（3）：477-485.

[2]孙菊英，郭朝辉.十种马勃体外抑菌作用的实验研究[J].中药材，1994，17（4）：37-38.

[3]陶文洲，吕竞竞，杨淑云，等.经纤维胃镜定位喷洒复方马勃液治疗上消化道出血的疗效观察[J].中西医结杂志，1987（1）：12-13.

[4]魏艳，高锦明，郝双红，等.担子菌黄硬皮马勃杀虫活性研究[J].西北植物学报，2005，25（2）：382-385.

[5]NG T B,LAM Y W,WANG H.Calcaelin,a new protein with translation inhibiting,antipro-liferative and antimitogenic activities from the mosaic puffballmushroomCalvatiacaelata[J].Planta Med,2003,69(3)：212-217.

[6]邓志鹏，孙隆儒.中药马勃的研究进展[J].中药材，2006，29（9）：996-998. [7]郭玫，张扬.中药马勃的研究概况[J].甘肃中医学院学报，2010，27（1）：60-62.

[8]赵会诊，胥艳艳，付晓燕.马勃的食药用价值及其研究进展[J].微生物学报，2007，34（2）：367-369.

[9]洒荣波，王辉，鹿慧，等.黄伞胞外多糖发酵培养条件的响应面法优化[J].中国酿造，2015，34（12）：69-72.

[10]宫春宇，郑玉萍，胡清秀，等.黄伞多糖的提取、纯化及增强免疫力功能研究[J].食品科技，2013，38（4）：195-199.

[11]苏方华，潘日兴.马勃的抗炎镇痛实验研究[J].齐鲁药事，2010，29（10）：586-588.

[12]敖素华，彭素岚，王俊峰.银翘马勃散加味治疗喉源性咳嗽50例[J].陕西中医，2005，26（12）：1273-1274.

[13]李顺峰，刘兴华，张丽华，等.真姬菇子实体多糖的提取工艺优化[J].农业工程学报，2008，24（2）：281-284.

[14]周莉，王永，王法云，等.食品中金黄色葡萄球菌概况及新型检测技术研究进展[J].中国酿造，2016，35（2）：1-4.

[15]李作美，李娜，王晓云，等.桶装纯净水的微生物检测与鉴定[J].中国酿造，2015，34（2）：163-167.

[16]李作美，许晖，曾晓雄.鼎湖鳞伞多糖的抑菌作用及抗氧化活性[J].食品与发酵工业，2013，39（11）：167-170.

Optimization of fermentation conditions of polysaccharide fromCalvatia gigantea mycelium and its antibacterial effect

LI Zuomei,WU Shanshan,CHEN Jia
(Department of Biology and Food Engineering,Bengbu University,Bengbu 233000,China)

The liquid state fermentation conditions of polysaccharides fromCalvatia giganteamycelia were optimized by single factor and orthogonal experiments.Using the bacteria as test strains,the antibacterial experiments of polysaccharides extracted fromC.giganteamycelia were conducted. The results showed that the optimum liquid state fermentation conditions were temperature 28℃,revolving speed 150 r/min and time 8 d.Under the optimum conditions,the mycelia dry mass was(7.08±0.51)g/L.The results of antibacterial experiments showed that polysaccharides fromC.gigantea mycelia had obviously inhibitory effect on gram-positive bacteria.And with the increasing of polysaccharide concentrations,the antibacterial effect was stronger.

Calvatia giganteanmycelia;polysaccharide;liquid state fermentation;antibacterial effect

TS201.3

0254-5071（2016）08-0120-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.027

2016-03-29

2013年度安徽高等学校省级自然科学研究项目（KJ2013Z202）

李作美（1975-），女，讲师，硕士，研究方向为食品生物技术。