响应面法优化高效聚磷菌P2除磷条件的研究

方春玉，周健，明红梅，赵兴秀，陈蒙恩，姚霞

（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）

响应面法优化高效聚磷菌P2除磷条件的研究

方春玉，周健，明红梅，赵兴秀，陈蒙恩，姚霞

（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）

采用浊度法对高效聚磷菌P2的生长趋势进行了测定，通过单因素设计，探究了培养温度、初始pH值、培养时间及微量元素添加量对高效聚磷菌P2除磷性能的影响，利用Plackett-Burman设计从影响除磷率的6个因素中筛选出3个主效因素，最后通过Box-Behnken设计对除磷条件进行优化，以期最大限度的提高聚磷菌P2除磷效率。结果表明，高效聚磷菌P2在24 h后生长趋势达到稳定，且持续时间较长；响应面法优化菌株P2的除磷最优条件为初始化学需氧量（COD）494.5 mg/L、初始pH值7.4、接种量5%、初始磷含量50 mg/L、培养温度35℃、培养时间10.5 h，此条件下对磷酸盐的积累能力最强，对磷酸盐的去除率可达到92.51%。

聚磷菌；响应面法；除磷条件

微生物除磷是通过具有超量摄磷功能的聚磷类微生物的超量吸磷能力实现的[1-3]，在通常的生物处理系统中，一方面磷作为活性污泥中微生物生长所需元素之一而得以部分去除[4]；另一方面在活性污泥中还存在着一类具有超量吸磷能力的微生物（聚磷菌）将污水中的磷酸盐吸附而去除。聚磷菌处理废水效率与这类微生物所要求的环境条件关系密切，只有在最适合其生长繁殖和有效利用营养基质的条件下，才能发挥其最大潜能。由于在白酒废水处理的末端，废水中有机物含量较低，再加上与其他菌落的竞争等因素，致使污水处理系统中的聚磷菌不能发挥最大除磷功效。为使废水达标排放，许多污水处理厂往往采取投加除磷剂的方法，这样就会在后期的氧化塘中产生大量的化学污泥。当产生的化学污泥足够多时则需定期进行人工除污，进而增加了额外的人力成本与经济费用。因此，在上一阶段的污水处理中能否实现高效除磷成为解决这一系列问题的关键。

本研究用聚磷菌P2处理含磷的白酒废水，采用响应面法的数学方法进行实验设计，从而快捷有效的找出菌株P2的最优除磷条件，从而达到聚磷菌高效除磷的目的，为聚磷菌P2的在含磷废水中的高效应用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种来源

高效聚磷菌P2：泸州老窖股份有限公司罗汉污水处理站周期循环活性污泥（cyclicactivatedsludgesystem，CASS）反应池污泥中分离。

1.1.2试验用水

实验用水为取自罗汉污水处理站中间水池废水添加一定量的化学试剂，添加比例及水质特征见表1所示。

表1　配制废水成分及最终水质特征Table 1 Composition and quality characteristics of configuration waste water

1.1.3培养基

聚磷培养基：MgSO4·7H2O 82 mg，无水乙酸钠1.0 g，（NH4）2SO40.2 g，CaCl260 mg，KH2PO474 mg，微量元素溶液2 mL，蒸馏水1 000 mL、pH 7.0～7.2。

专性培养基：（NH4）2SO40.2 g，CH3COONa 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.1 g，CaCl20.06 g，微量元素溶液2 mL，加水至1 000 mL，pH7.0～7.2。

1.2仪器与设备

8220BNWP精密pH计：热电（上海）科技仪器有限公司；ST8型恒温高速离心机：美国赛默飞世尔公司；CTL-BX3C COD速测仪：承德华通自动化工程有限责任公司；5B-6C总磷测定仪：上海连华实业有限公司；55i+Ds-SM-U1生物显微成像系统：日本NIKON公司；SCAN1200影像分析菌落计数仪：上海智理科学仪器有限公司；MILLI-Q超纯水仪：美国Millipore公司。

1.3试验方法

1.3.1生长曲线的测定

将菌种活化后，接种到专性培养基中，在30℃、150 r/min条件下好氧振荡培养12h，制备成种子液制备；取盛有50 mL无菌专性培养液的250 mL三角瓶30个，将其依次编号为1、2、3、4、5、……、30。用移液枪分别吸取2 mL种子液后好氧振荡培养。每隔6h分别取出一瓶，并立即放入-20℃冰箱中，待培养结束时一同测定其吸光度值（OD600nm）。

1.3.2单因素试验

初始pH值对高效聚磷菌P2除磷率的影响[13]：将5%的种子液分别接入5个含有已灭菌聚磷培养基的250 mL三角瓶中，并依次进行标记，所标记的三角瓶中培养基的初始pH值依次为5、6、7、8、9，30℃、150 r/min摇床振荡培养12 h，培养结束后对其除磷率进行测定，计算除磷率。

培养温度对高效聚磷菌P2除磷率的影响：将5%的种子液分别接入5个含有已灭菌聚磷培养基的250 mL三角瓶中，并依次进行标记，所标记的三角瓶其培养温度依次为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，150r/min摇床振荡培养12h，培养结束后对其磷含量进行测定。

培养时间对高效聚磷菌P2除磷率的影响：将5%的种子液分别接入5个含有已灭菌聚磷培养基的250 mL三角瓶中，并依次对其进行标记，30℃、150 r/min摇床振荡分别培养6 h、12 h、18 h、24 h、30 h，培养结束后对其磷含量进行测定，计算除磷率。

微量元素添加量对高效聚磷菌P2除磷率的影响：将5%的种子液分别接入5个含有已灭菌聚磷培养基的250mL三角瓶中，并依次进行标记，每个三角瓶中微量元素添加量依次为0、1 mL/L、2 mL/L、3 mL/L、4 mL/L、5 mL/L，30℃、150 r/min摇床振荡培养12 h，培养结束后对其磷含量进行测定，计算除磷率。

初始COD含量对除磷率的影响：将5%的种子液分别接入5个含有已灭菌聚磷培养基的250 mL三角瓶中，培养基的初始COD值分别为200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L、800 mg/L，在30℃、150 r/min摇床振荡培养12 h，培养结束后对其磷含量进行测定，计算除磷率。

1.3.3响应面法优化高效聚磷菌P2的除磷条件

PB设计筛选影响高效聚磷菌除磷特性的显著影响因子：以除磷率（Y）为响应值，通过Plackett-Burman设计，从影响除磷率的6个影响因素（培养温度、初始pH值、初始COD含量、菌种接种量、初始磷含量、时间）中筛选出主效因素。每个因素取2个水平：即“1”水平和“-1”水平，以尽快而有效地筛选出最为重要的几个因素[14]。试验因素及水平见表2。

表2　Plackett-Burman试验因素与水平Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman tests design

最陡爬坡试验的设计：根据Plackett-Burman试验设计找出主效因素后进行最陡爬坡试验，依据各因素效应值大小确定其步长，以便快速逼近最佳响应区，并建立有效的响应面拟合方程[15]。

Box-Behnken试验设计：以PB试验确定的主效因素为设计因素，最陡爬坡试验确定的最优水平作为中心点设计Box-Behnken试验[16]，试验因素的设计水平及编码见表3。

表3　Box-Benhnken试验设计的因素及水平Table 3 Factors and levels in Box-Benhnken tests design

1.3.4测定方法[12]

COD测定：COD快速测定仪；TP：GB11893—1989《总磷的测定钼酸铵分光光度法》测定；NH4-N：NH4-N测定仪；pH：精密pH计；混合液悬浮固体浓度（mixed liquid suspended solids，MLSS）：量筒直接测量；菌体生长密度：浊度法（OD600nm）。

2　结果与分析

2.1生长曲线的测定

对菌株进行生长曲线的测定，结果如图1所示。

图1　聚磷菌P2生长曲线Fig.1 Growth curve of phosphorus-accumulating bacterium P2

由图1可知，菌株P2的生长迟缓期为0～6 h；第6～24小时时菌株生长迅速，表明此时菌株处在对数期；24 h后曲线的上升趋势开始变得缓慢；48 h后其细胞浓度达到最大，即进入稳定期。故其作为种子液的最佳时间段为12～24 h。从菌株P2生长曲线的整体趋势可知，其稳定期时间相对较长，说明菌株P2能够在较低COD浓度条件下存活较长时间，即说明菌株P2对环境的适应能力较强。

2.2单因素试验

2.2.1不同初始pH值对除磷率的影响

发酵过程中，改变培养基的初始pH值，考察不同初始pH值条件下菌株P2的除磷能力，结果如图2所示。

图2　初始pH值对除磷率的影响Fig.2 Effect of initial pH on phosphorus removal efficiency

由图2可知，菌株P2的除磷率随着初始pH值的变大呈先上升后下降趋势，且在pH=7附近时其除磷率最高，说明菌株P2的最佳除磷pH值为近中性，较高或较低的pH值都不适宜菌株P2对磷的吸收。这是因为在较高或较低pH值时菌株P2的生理活性受到抑制，也可能是起催化作用的酶的合成或其活性受到了抑制。因此，在进行污水处理时需要及时监测并及时调节水质pH值=7，以便能够达到最大除磷效率。

2.2.2不同培养温度对除磷率的影响

发酵过程中，采用不同温度进行培养，检测菌株P2的除磷能力，结果如图3所示。

图3　培养温度对除磷率的影响Fig.3 Effect of culture temperature on phosphorus removal efficiency

由图3可知，随着温度的升高，菌株P2的除磷率开始上升，但升幅不大，且随着温度的升高，菌株P2的除磷率增加趋势加大，在30℃附近时达到最大（接近100%）。之后随着温度的升高，菌株P2的除磷率开始急剧下降，且下降趋势随温度的升高而增大。以上现象说明适当提高温度有助于提高菌株除磷率，但当培养温度过高时，由于菌株活性或体内相关酶或许受到抑制，反而达不到提高除磷率的目的。因此，在利用菌株P2进行除磷时，温度宜控制在30℃左右。

2.2.3不同培养时间对除磷率的影响

在不同培养时间下检测发酵液中的磷含量，以确定除磷的最佳利用时间，结果如图4所示。

图4　培养时间对除磷率的影响Fig.4 Effect of culture time on phosphorus removal efficiency

由图4可知，随着培养时间的增加，菌株P2在12 h左右时其除磷率最大，12 h后菌株P2的除磷率略有下降。这是由于随着培养时间的延伸，培养液中可利用的COD量逐渐降低，此时聚磷菌P2无法再吸收过量磷元素，甚至部分菌株开始发生释磷现象以获取能量。因此，培养时间宜控制在12 h。

2.2.4不同微量元素溶液添加量对除磷率的影响

在发酵液中添加不同量的微量元素溶液，考察不同微量元素溶液添加量对除磷率的影响，结果如图5所示。

图5　微量元素溶液添加量对除磷率的影响Fig.5 Effect of trace elements solution addition on phosphorus removal efficiency

由图5可知，当聚磷培养基中不添加微量元素时，聚磷菌P2的除磷率较低，随着微量元素添加量的增加，聚磷菌P2的除磷率呈先上升后下降趋势，说明微量元素含量能够影响聚磷菌P2对磷元素的吸收。当微量元素添加量为2 mL/L左右时P2除磷能力最强，之后随着微量元素含量的增加呈急剧下降之势，说明在进行污水处理时，可根据污水成分适当地添加微量元素，从而进一步提高除磷能力。因此，微量元素溶液添加量宜控制在2 mL/L。

2.2.5不同初始COD含量对除磷率的影响

考察不同初始COD含量下，聚磷菌的除磷效率，结果如图6所示。

图6　初始COD值对除磷率的影响Fig.6 Effect of initial COD on phosphorus removal efficiency

由图6可知，随着初始COD含量的增加，聚磷菌P2的除磷率呈先上升后下降趋势，在初始COD含量为500 mg/L时P2除磷能力最强。原因可能是随着初始COD含量的增加，培养基浓度更高，聚磷菌生长迅速，其除磷效率也不断增高，但过高的营养基质，也会影响除磷效率，菌体在较高COD条件下，生长受到一定的抑制。因此，初始COD含量宜控制在500 mg/L。

2.3响应面法设计试验

2.3.1 Plackett-Burman设计结果与分析

运用Design-Expert 8.0.5软件对PB试验的结果进行方差分析，其试验设计结果及效应评价分别见表4、表5。

表4　Plackett-Burman试验设计及响应值Table 4 Plackett-Burman experimental design and response value

根据表4的Y（%）值，进行各因素水平及其效应评价，计算结果如表5所示。

由表5可知，所考察的6个因素对除磷率的影响大小依次为X6＞X1＞X3＞X5＞X4＞X2，其中X1、X3、X6对结果影响较大，为主效因素。

表5　Plackett-Burman试验结果显著性分析Table 5 Significant evaluation of Plackett-Burman experiments results

2.3.2最陡爬坡试验结果及分析

依据表5结果，对3个主效因素进行最陡爬坡试验，根据3个主效因素效应大小设定变化步长及方向。对于不显著因素，表现为正效应的取“1”水平，表现为负效应的取“-1”水平[17]，其梯度变化及试验结果见表6。从表6可知，随着3个主效因素梯度的变化，菌株P2除磷率呈先上升后下降趋势，在2号所处水平上达到最大值，故而判定菌株P2的最优除磷条件在2号附近，故选2号所处的因素水平为中心点进行后续响应面优化设计。

表6　最陡爬坡试验设计及结果Table 6 Experimental design and results of the steepest ascent test

2.3.3响应面试验结果及分析

运用Design-Expert 8.0.5软件对最陡爬坡试验中所确定的中心点进行3因素3水平的Box-Behnken试验设计，试验设计及结果见表7。

运用Design-Expert8.0.5版软件对模型进行二次回归拟合后，得到以下回归方程：Y=92.40+0.29A+0.039B-2.73C-1.67AB+1.53AC+1.09BC-2.55A2-1.24B2-5.31C2，回归模型的方差分析见表8。

从表8可知，模型Pr值＜0.001，F值为20.06，说明模型极为显著。从方差分析的结果可知，模型的失拟项Pr=0.0605＞0.05，说明该模型选择比较合理。模型中C、C2对响应值影响极显著（P＜0.01），AB、AC、A2对响应值值影响显著（P＜0.05）且模型决定系数R2为96.27%，表明该模型与实际情况拟合良好，可以用于对高效聚磷菌P2的最佳除磷条件进行分析和预测。利用响应面回归分析、回归方程和Design-Expert 8.0.5软件绘制三维响应曲面图，结果见图7。

表7　Box-Behnken试验设计及结果Table 7 Design and results of Box-Benhnken experiments

表8　回归方程的方差分析Table 8 Variance analysis of regression equation

响应曲面可直观反映出各因对响应值的影响，曲面越陡说明相关因素之间的交互作用越强[18]。从图7可以看出，当各因素大小从四周逐渐趋向中心点时，曲面图呈凸起趋势，即聚磷菌的除磷率趋向最大化，说明存在最大响应值。运用Design-Expert 8.0.5软件对其结果进行分析，当预测的响应值最大时，3个因素所对应的最佳值为培养时间10.51 h、初始COD含量494.52 mg/L、初始pH值7.37时，在该条件下所预测的最大除磷率为92.75%。

图7　培养时间、初始COD含量与初始pH值交互影响对除磷率影响的响应曲面和等高线图Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of the interaction between culture time,initial COD,and initial pH on phosphorus removal efficiency

2.3.4验证试验及结果

为方便操作，修改最佳条件为培养时间10.5 h、初始COD含量494.5 mg/L、初始pH值7.4，对菌株P2的除磷能力进行验证，结果显示，高效聚磷菌对磷酸盐的去除率可达到92.51%，这与回归方程所提供的预测值（92.75%）相接近，证明拟合模型能够准确的对菌株P2的除磷条件进行优化。

3　结论

对高效聚磷菌P2的除磷条件进行优化，在浊度法对菌株P2的生长趋势进行了测定时发现，菌株的对数生长期为6～24 h，24 h后菌株P2的生长呈下趋势，48 h后生长趋于停止，但数量达到了最大，说明进入了稳定期。稳定期持续相当长一段时间，说明菌株P2对环境的适应能力较强，尤其在较低COD浓度条件下可以存活较长时间。

通过单因素试验设计，找到影响菌株P2除磷效果的因素及其作用范围，利用响应面法对菌株P2的除磷条件进行优化设计。结果显示，菌株P2的最佳除磷条件为培养时间10.5 h、初始COD含量494.5 mg/L、初始pH值7.4、接种量5%、初始总磷50 mg/L、培养温度35℃，在此条件下除磷率可达到92.51%。

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Optimization of phosphorus removal conditions with efficient phosphorus-accumulating bacterum P2by response surface methodology

FANG Chunyu,ZHOU Jian,MING Hongmei,ZHAO Xingxiu,CHEN Mengen,YAO Xia
(College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China)

The growth trend of the efficient phosphorus-accumulating bacterum P2was researched by testing turbidity value.The effect of temperature, initial pH,culture time and trace elements addition on phosphate removal efficiency was researched by single factor experiment.Three main factors were selected from six influencing factors by the design of Plackett-Burman.Finally,the response surface methodology experiment was designed to investigate the optimal phosphorus removal conditions,to maximumly improve phosphorus removal efficiency of strain P2.The results showed that the growth trend of efficient phosphorus-accumulating bacterum P2was stable after 24 h,and sustained for a long time.The response surface methodology results showed that the optimal phosphorus removal condition by strain P2was initial COD concentration 494.5 mg/L,initial pH 7.4,inoculum 5%,initial phosphorus content 50 mg/L,temperature 35℃and time 10.5 h.Under the condition,the accumulation ability of the phosphate was the strongest,and the removal efficiency of phosphate was 92.51%.

phosphorus-accumulating bacterium;response surface methodology;phosphorus removal conditions

Q939.9

0254-5071（2016）08-0104-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.08.024

2016-02-23

酿酒及生物技术四川省重点实验室项目（NJ2014-05）；泸州老窖科研奖学金项目（15ljzk06）；四川省大学生创新基金项目（201510622061）；四川理工学院培育项目（2015PY02）；自贡市科技局（2015HX15）

方春玉（1977-），女，高级实验师，硕士，主要从事环境生物技术方面的研究工作。