E-选择素蛋白及mRNA在胃腺癌中的表达及其临床意义

王 闯 石建芹 刘继微 齐洁敏

(承德医学院生理教研室，河北 承德 067000)



E-选择素蛋白及mRNA在胃腺癌中的表达及其临床意义

王 闯 石建芹 刘继微 齐洁敏

(承德医学院生理教研室，河北 承德 067000)

目的 检测胃腺癌组织中E-选择素蛋白及mRNA的表达及其临床意义。方法 应用免疫组化法、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术联合检测90例胃腺癌组织及50例正常胃黏膜组织中E-选择素蛋白及mRNA的表达情况。结果 胃腺癌组织 E-选择素蛋白及mRNA表达均高于正常胃黏膜组织(P<0.05)。E-选择素蛋白及mRNA在胃腺癌组织中的表达均与分化程度、淋巴结转移、浸润深度、TNM分期相关(P<0.05)，与年龄、性别无关(P>0.05)。结论 E-选择素与胃腺癌的发生、发展密切相关，将为评估胃腺癌的浸润、转移潜能和预后提供理论依据。

胃腺癌；E-选择素

胃腺癌的浸润、转移是宿主细胞和肿瘤细胞之间相互作用多步骤、多因素的复杂过程,该过程包括癌细胞间以及癌细胞和基底膜、细胞外基质之间黏附力的改变，基底膜和细胞外基质的降解，癌细胞的迁移及癌组织中血管的形成〔1〕。所以作为细胞黏附分子的E-选择素在胃腺癌发生、发展中有非常重要的作用。E-选择素在胃腺癌中的表达及生物学行为的研究尚未见报道。本研究采用免疫组化(SP法)、RT-PCR技术联合检测E-选择素蛋白及mRNA在胃腺癌组织中的表达情况，探讨其在胃腺癌的发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年11月至2014年5月手术切除并经病理专家确诊为胃腺癌患者90例，男56例，女34例；高分化、中分化52例，低分化、未分化38例；平均年龄(62±8.0)岁；淋巴结转移者61例。距离癌灶>10 cm处癌旁正常胃黏膜组织50例(对照组)，男30例，女20例，平均年龄(61±7.0)岁，两组间年龄及性别构成差异无统计学意义(P>0.05)。全组病例术前均未行激素治疗及放化疗。

1.2 试剂与方法 免疫组化标本经中性甲醛液固定后进行石蜡包埋，5 μm厚度连续切片备用；RT-PCR标本获取后立即保存于-80℃的超低温冰柜内。

1.2.1 主要试剂 兔免疫组化试剂盒：北京四正柏生物科技有限公司生产。兔抗E-选择素多克隆 IgG 抗体为北京博奥森生物技术有限公司生产。逆转录反应试剂盒和DL1000 DNA Marker均购于Takara公司，所有引物序列由上海Invitrogen公司合成。

1.2.2 免疫组化 采用SP法，抗体浓度为1∶100，染色过程参照免疫组化试剂盒说明书进行。阴性对照：用PBS代替一抗；阳性对照：用已知阳性切片组织(试剂公司提供)。E-选择素阳性表达主要定位于细胞质，呈棕黄色颗粒状，表达水平采用阳性细胞数和染色强度评分综合判定〔2〕。阳性细胞数评分标准为：0分：阳性细胞数<10%；1分：阳性细胞数<25%；2分：阳性细胞数<50%；3分：阳性细胞数≥50%。染色强度评分标准为：0分：阴性，与背景色完全一致；1分：弱阳性染色，呈淡黄色，略深于背景色；2分：阳性染色，呈中等黄色，明显深于背景色；3分：强阳性染色，呈棕黄色。每张切片总评分等于阳性细胞数+染色强度评分，总分0～1分为阴性表达(0)，2～3分为低表达(+)，4～5分为中强度表达()，6分以上为高强度表达()。

1.2.3 RT-PCR 按照Trizol试剂说明书抽提组织总RNA含量，OD260/OD280分光光度计检测RNA浓度及纯度，并用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。逆转录反应及PCR反应体系按照说明书配置，均为20 μl，严格按照试剂盒说明书进行操作，逆转录成的cDNA及合成的目的DNA均放在-20℃保存备用。引物序列：内参β-actin的上游引物：5'-CCTGTGGCATCCACGAAACT-3'，下游引物：5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'，片段长度为315 bp；E-选择素上游引物：5'-CATCATGGAACCGACTGCT-3'，下游引物：5'-ATGGCCACTGCATGACCA-3'，片段长度为150 bp。反应条件为：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸5 min，最终4℃结束反应。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统采图，并用Quantity One软件对电泳图进行相对表达量分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行χ2及t检验。

2 结 果

2.1 E-选择素在胃腺癌组织、癌旁正常胃黏膜组织中的表达情况 RT-PCR检测结果：图1可见，琼脂糖凝胶电泳图显示，

M：Marker；1、6：低、未分化组胃腺癌组织；2、5：高、中分化组胃腺癌组织；3、4：癌旁正常胃黏膜组织图1 胃腺癌组织和癌旁正常胃黏膜组织中E-选择素mRNA的表达

在150 bp处、315 bp处有特异性条带，分别代表E-选择素、内参β-actin，E-选择素在胃腺癌组和对照组相对表达量分别为(0.693±0.106)、(0.489±0.024)，二者差异显著(t=13.148，P< 0.05)。免疫组化检测结果：E-选择素蛋白在对照组中无表达。阳性产物的表达主要位定于细胞质，呈现棕黄色颗粒状。E-选择素蛋白在胃腺癌组织中表达的阳性率为70.0%，明显高于对照组(χ2=32.202,P<0.05)。见图2。

2.2 胃腺癌组织E-选择素蛋白及mRNA的表达与临床生物学行为的关系 免疫组化检测结果和RT-PCR的检测结果是一致的，E-选择素蛋白及mRNA的表达在胃腺癌组织中的表达均与年龄、性别无关(P>0.05)，均与胃腺癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期密切相关(P<0.05)。见表1。

图2 E-选择素蛋白在不同胃黏膜组织中的表达(DAB，×200)

组别nE-选择素蛋白阳性甲〔n(%)〕χ2值P值E-选择素mRNAmRNA表达量t值P值年龄(岁)<60/≥6029/6119(65.5)/44(72.1)0.409>0.050.663±0.103/0.709±0.1051.713>0.05性别男/女56/3438(67.9)/25(73.5)0.324>0.050.666±0.105/0.711±0.1041.694>0.05分化程度高、中分化/低、未分化52/3829(55.8)/34(89.5)11.877<0.050.602±0.057/0.771±0.02010.923<0.05浸润深度未到浆膜组/达浆膜组49/4127(55.1)/36(87.8)11.368<0.050.595±0.055/0.768±0.06511.426<0.05转移转移组/未转移组61/2936(59.0)/27(93.1)10.875<0.050.617±0.077/0.792±0.01913.423<0.05分期Ⅰ、Ⅱ期/Ⅲ、Ⅳ期47/4326(55.3)/37(86.0)10.096<0.050.613±0.077/0.747±0.0877.845<0.05

3 讨 论

选择素是细胞黏附分子家族中的成员之一，包括：P-选择素、L-选择素和E-选择素。研究表明，E-选择素有多种配体：Slex和Slea及相关的寡聚糖。E-选择素与其配体结合后，可能与肿瘤的浸润、转移有关〔3〕。目前已有研究表明E-选择素在乳腺癌〔4〕、卵巢癌〔5〕、肝癌〔6〕、食管癌〔7〕、结肠癌〔8〕、胶质瘤〔9〕等肿瘤细胞中都有表达。仇爱峰等〔4〕用免疫组化方法检测到：乳腺癌组织中E-选择素表达显著高于癌旁组织中的表达(P<0.01)；乳腺癌组织中 E-选择素的表达与肿瘤分期、肿瘤分化程度、肿瘤直径等明显相关，E-选择素介导了乳腺癌的发生发展及淋巴结转移。史梅英等〔5〕用免疫组化方法检测：卵巢癌组织中 E-选择素表达阳性率高于正常上皮(P<0.01),有淋巴结转移的癌组织中E-选择素表达的阳性率高于无淋巴转移癌组织。张宝华等〔6〕用流式细胞仪及免疫组化检测证实E-选择素与肝癌转移密切相关。

本实验从蛋白水平和基因水平上对正常胃黏膜组织及胃腺癌组织中E-选择素蛋白和mRNA的表达情况进行直观的检测，更好地阐述E-选择素的表达情况与临床生物学行为(年龄、性别、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期)的关系，所以技术方面分别选用免疫组织化学方法与RT-PCR技术，数据分析显示两种检测所得结论一致，从而更准确地证实了E-选择素在胃腺癌的发生、发展中尤其是浸润、转移中的重要作用。综上所述，E-选择素在胃腺癌中的过表达促进其发生、发展，尤其是从胃腺癌生物学行为关系表明，E-选择素也与胃腺癌的浸润、转移密切相关，但其具体的机制，有待进一步研究。

1 吴 菲,林国桢,张晋昕.我国恶性肿瘤发病现状及趋势〔J〕.中国肿瘤,2012;21(2):81-5.

2 Barthel SR,Gavino JD,Descheny L,etal.Targeting selections and selectin ligands in inflammation and cancer〔J〕.Expert Opin Ther Targets,2007;11(11):1473-91.

3 付丽梅,孙 青.E-选择素的研究进展〔J〕.医学综述,2008;14(2):185-6.

4 仇爱峰,徐 青,王庆庆.乳腺癌组织中E-选择素及其配体的表达及临床意义〔J〕.中国交通医学杂志,2006;20(1):20-2.

5 史梅英，赵志英.E-选择素在上皮性卵巢癌患者中的表达及其临床意义〔J〕.中国妇产科临床杂志，2011;12(5):369-71.

6 张宝华,陈 汉,姚晓平,等.E-选择素及其配体slex在肝癌转移中的意义〔J〕.中华外科杂志,2000;38(7):534-6.

7 李丛丛，杨锡贵，姜 超，等.E-选择素在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义〔J〕.肿瘤防治研究，2013;40(11)：1050-3.

8 张 春,刘吉成.E-选择素在结肠癌中的研究现状〔J〕.齐齐哈尔医学院学报,2008;29(20):2502-4.

9 傅 军,张 一,周幽心,等.E-选择素、P-选择素在人脑胶质瘤中的表达意义〔J〕.四川医学,2009;30(11):1696-8.

〔2015-04-04修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

齐洁敏(1966-)，女，教授，硕士生导师，主要从事生殖系统肿瘤研究。

王 闯(1986-)，女，助教，硕士，主要从事于生殖系统肿瘤研究。

R735.2

A

1005-9202(2016)20-5049-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.051