截断型载脂蛋白E对神经元tau蛋白和神经细丝磷酸化的影响

董 翔 常 庚

(大连医科大学附属第一医院神经内科，辽宁 大连 116011)



截断型载脂蛋白E对神经元tau蛋白和神经细丝磷酸化的影响

董 翔 常 庚

(大连医科大学附属第一医院神经内科，辽宁 大连 116011)

目的 探讨截断型载脂蛋白(Apo)E对神经元中tau蛋白和神经细丝磷酸化的影响。方法 构建真核表达重组体pEGFP-T-ApoE4，培养小鼠成神经瘤细胞系，并将pEGFP、pEGFP-ApoE4和pEGFP-T-ApoE4质粒转染N2a细胞，采用免疫印迹法测定转染细胞内磷酸化tau蛋白和神经细丝含量。结果 不同质粒转染组N2a细胞中磷酸化tau蛋白表达明显不同，pEGFP-T-ApoE4组>pEGFP-ApoE4组>pEGFP-C3组(P<0.05)；不同质粒转染组N2a细胞中磷酸化神经细丝表达不同，pEGFP-T-ApoE4组>pEGFP-ApoE4组>pEGFP-C3组(P<0.05)。结论 截断型ApoE能够促进N2a细胞tau蛋白和神经细丝磷酸化，推测其可能是增加阿尔茨海默病(AD)患病风险及促进病程进展的原因之一。

截断型载脂蛋白E；N2a细胞；tau蛋白；神经细丝；磷酸化

阿尔茨海默病(AD)以失语、失用、失认、记忆障碍、执行功能障碍及人格、行为改变等为特征〔1，2〕，AD患者生活质量严重下降，给家庭和社会带来沉重的负担〔3〕，其主要病理基础是老年斑形成和神经元纤维缠结。研究表明〔4，5〕，载脂蛋白(Apo)E-ε4等位基因能显著增加神经元纤维缠结数量，而神经元纤维缠结数量与AD程度呈正比。截断型ApoE是ApoE4被蛋白酶水解C末端272～299位氨基酸残基后的片段，研究表明〔6〕，截断型ApoE4大量存在于神经元纤维缠结中，并且可以加剧AD动物模型病理改变进程。微管相关tau蛋白和神经细丝过度磷酸化是形成神经元纤维结的主要成分〔7〕，本研究探讨ApoE4与tau蛋白和神经细丝磷酸化的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 小鼠成神经瘤细胞系N2a细胞购自上海信则生物，胎牛血清(FBS)、Opti-MEM购自美国Hyclone公司，pEGFP-ApoE4由大连医科大学基础医学院提供，pEGFP-C3、DNA纯化试剂盒及核酸片段回收试剂盒均购自美国Clontech公司，限制性核酸内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、T4 DNA连接酶均购自美国NEB公司，Lipofectamine2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，ApoE多克隆抗体购自北京利德曼生化公司，tau磷酸化抗体和神经细丝磷酸化抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养 将小鼠成神经瘤细胞系N2a细胞用FBS培养基在5%CO2条件下于37℃培养箱中进行培养，培养液3 d更换一次，待细胞达到80%丰度左右时，进行传代或试验。

1.3 真核表达重组体pEGFP-T-ApoE4的构建 利用Primer5.0软件设计引物，上游：5′-TTTTGAATTCTGATGAAGGTTCTGTGGGCTGCG-3′，加入EcoRⅠ酶切位点；下游：5′-TTTTGGATCCTCAGTCTTCCACCAGGGGCTCG-3′，加入BamHⅠ酶切位点和终止密码子。用pEGFP-ApoE4当模板扩增截断型ApoE4 cDNA片段，按照扩增参数进行设定，共循环25次后，继续72℃延伸10 min。将扩增片段与pEGFP-C3质粒分别进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，于1%琼脂糖电泳后，回收片段，将截断型-ApoE4 cDNA片段和pEGFP-C3大片段按照3.5∶1进行混合，将T4 DNA连接酶加入后，在15℃水浴中进行片段连接16 h。将产物转化感受态细菌HB101，进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，获得pEGFP-T-ApoE4重组体，进行大量质粒制备并进行纯化。

1.4 质粒转染 ①pEGFP-T-ApoE4质粒瞬时转染：转染前1 d，将培养细胞用胰蛋白酶进行消化后计数，并接种在预先放置poly-L-lysine涂层小皿的24孔板中，培养24 h，取一定量重组质粒加入1/10体积3 mol/L乙酸钠和2倍体积无水乙醇，于冰上放20 min，在4℃条件下于12 000 r/min进行离心10 min，将上清弃去，用70%乙醇进行洗涤2次，弃去上清，于无菌超净台晾干，按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书进行转染操作。②质粒稳定转染：取纯化质粒DNA 2.7 μg稀释至250 μl，取Lipofectamine2000 5 μl稀释到250 μl，37℃放5 min，混匀静置20 min，加入到含OPTI-MEM 1.5 ml的6孔板中，混匀，室温培养6 h，换FBS培养基培养48 h，加入800 μg/ml的G418进行筛选2 w，3 d换液1次。2 w后400 μg/ml的G418筛选1个月，存活细胞为转染成功细胞。③稳定转染并表达ApoE4的N2a细胞接种于250 ml培养瓶中，至85%丰度时，进行无血清培养基2次洗涤后，预孵育2 h，无血清培养基洗涤1次后，过夜培养。收集培养基并保存。1 w收集2次，连续1个月。进行离心、浓缩，利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检查ApoE含量，并保存待用。

1.5 蛋白样本的制备与测定 将N2a细胞接种在六孔板中培养25～35 h，使细胞丰度达到75%左右，转染pEGFP、pEGFP-ApoE4和pEGFP-T-ApoE4质粒后，培养24 h，观察细胞生长情况。移除培养基，用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，加入200 μl细胞裂解液中进行裂解后，将细胞刮下并移至EP管中进行超声破碎3次，每次10 s，进行12 000 r/min离心10 min后，取上清。采用Western印迹测定蛋白含量：分别采用10%和7.5%分离胶分离tau蛋白和神经细丝蛋白；向制备好的样品中加入相应体积4倍上样缓冲液，振荡20 s，水浴锅煮沸5 min，将样品用微量加样器置入各泳道，根据蛋白含量不同加入不同体积，使各组蛋白总量一致。加样后进行蛋白电泳分离和电转移；利用ECL显色系统进行免疫印迹显色，并用扫描仪进行扫描，利用Image-Pro Plus图像处理软件进行分析。

1.6 统计学处理 利用SPSS17.0统计进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1 质粒转染和表达情况 分别将pEGFP-C3、pEGFP-ApoE4、pEGFP-T-ApoE4质粒转染过的N2a细胞置于荧光显微镜下进行观察，除对照组细胞外，各转染细胞均出现较强的荧光(图1)。利用ApoE多克隆抗体进行Western印迹检测，四组转染细胞均出现显色条带，对照组和pEGFP-C3、pEGFP-ApoE4转染组条带为34 kD，pEGFP-T-ApoE4转染组为30 kD；以对照组为内参照，pEGFP-ApoE4转染组和pEGFP-T-ApoE4转染组ApoE表达量分别为2.73±0.24和2.87±0.21，均高于pEGFP-C3转染组蛋白表达量(0.46±0.12)，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图1 荧光显微镜下不同质粒转染N2a细胞后表达荧光情况

图2 不同质粒转染N2a细胞后蛋白表达情况(Western印迹)

2.2 截断型ApoE过表达对tau蛋白和神经细丝磷酸化影响 不同转染组N2a细胞中磷酸化tau蛋白表达不同，pEGFP-T-ApoE4组>pEGFP-ApoE4组>pEGFP-C3组；不同转染组N2a细胞中磷酸化神经细丝表达不同，pEGFP-T-ApoE4组>pEGFP-ApoE4组>pEGFP-C3组，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)(表1、图3)。

表1 不同转染组N2a细胞中磷酸化tau蛋白和神经细丝表达情况

图3 不同转染组N2a细胞中磷酸化tau蛋白和神经细丝表达情况(Western印迹)

3 讨 论

研究发现〔8，9〕，ApoE在AD病程进展中发挥重要作用，其同分异构体ApoE4是AD的易感因子，能够增加患病风险并加速病程进展。在AD病理过程中，神经纤维缠结形成是主要病理改变，而过度磷酸化的tau蛋白和神经细丝是神经纤维缠结的重要组成成分〔10〕。有研究指出〔11〕，神经纤维缠结中存在大量的截断型ApoE4，而不是全长的ApoE4，提示截断型ApoE4可能参与了神经纤维缠结的形成。

本研究成功构建真核表达体，pEGFP-ApoE4和pEGFP-T-ApoE4质粒在培养的细胞中成功表达。神经细丝是神经细胞中一种中等纤维，tau蛋白是神经细胞中微管相关蛋白，两者共同维持了神经细胞的正常形态，能够促进微管组装并维持稳定和正常功能〔12〕，过度磷酸化的神经细丝能够抑制其与微管的相互作用，破坏细胞正常的构架结构，而磷酸化的tau蛋白则丧失生物学功能和活性，导致神经元退化，是AD发病的重要原因〔13〕。本研究说明ApoE4过度表达能够促进tau蛋白磷酸化，而截断型ApoE4过表达促进tau蛋白磷酸化的作用要强于全长的ApoE4。ApoE4过度表达可以加速神经细丝磷酸化，而截断型ApoE4过表达对神经细丝磷酸化的作用要强于全长ApoE4。综上，ApoE4和截断型ApoE4可以在N2a细胞中实现表达，过度表达的ApoE4和截断型ApoE4均能够导致神经细丝和tau蛋白磷酸化，而截断型ApoE4的作用更强，提示截断型ApoE4可能是增加AD发病风险和促进AD病程进展的原因之一，具体作用过程尚待进一步研究。

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7 Basurto-Islas GL，Luna-Muoz J，Guillozet-Bongaarts AL，etal. Accumulation of aspartic acid 421-and glutamic acid 391-cleaved tau in neurofibrillary tangles correlates with progression in Alzheimer disease〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol，2008；67(5)：470-83.

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〔2015-01-21修回〕

(编辑 安冉冉/曹梦园)

常 庚(1981-)，男，博士，副主任医师，主要从事痴呆研究。

董 翔(1975-)，男，博士，副主任医师，主要从事脑血管疾病及痴呆研究。

R743

A

1005-9202(2016)20-4991-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.021