结核分枝杆菌ClpX与人UBC9蛋白的相互作用抑制宿主细胞增殖

王亚倩，石 超，霍克克

(复旦大学 生命科学学院 遗传工程国家重点实验室，上海 200438)



结核分枝杆菌ClpX与人UBC9蛋白的相互作用抑制宿主细胞增殖

王亚倩，石 超，霍克克

(复旦大学 生命科学学院 遗传工程国家重点实验室，上海 200438)

ClpX是原核生物中高度保守的基因，其编码丝氨酸蛋白酶ClpXP的ATP结合亚基，具有底物识别及ATP水解活性.ClpX参与调控细胞周期与应激反应，且为多种病原微生物致病所必需，但目前相关研究仍非常有限.为了探索结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)ClpX在感染宿主细胞过程中的作用机制，本文首先通过酵母双杂交技术在人类淋巴细胞cDNA文库中筛选得到了一个新的与结核ClpX相互作用的蛋白UBC9，并利用GST pull-down和Co-IP技术证实了这两个蛋白在体外和体内相互作用的特异性.将ClpX转染HEK293T细胞过表达，RNA干扰与回复实验进一步证实了ClpX蛋白能够通过与UBC9的相互作用抑制宿主细胞的增殖.

结核分枝杆菌； ClpX； UBC9； 蛋白质相互作用； 细胞增殖

结核病(Tuberculosis)，作为全世界最致命的疾病之一，严重威胁人类健康.世界卫生组织(WHO)最新数据显示，仅2013年就有超过900万人发病，其中150万人死亡.结核病因结核分枝杆菌(以下简称结核杆菌)感染发生，据估算，全球现有超过6亿人感染结核杆菌，其中约10%最终发展为结核病[1].结核杆菌与宿主免疫系统间的交互最终决定感染者发病与否：一方面，结核杆菌通过减缓生长速度，降低物质和能量需求，以藏匿于宿主体内；或作用于宿主，减弱甚至抑制宿主细胞对它的杀伤.另一方面，宿主也激发免疫机制反作用于结核杆菌，譬如通过溶酶体杀灭、凋亡感染了结核杆菌的细胞，或呈递结核杆菌抗原特异性的T细胞，促进机体对结核杆菌的特异性清除[2].

蛋白酶对于结核杆菌的致病性和对巨噬细胞中的胁迫耐受有着至关重要的作用[3].结核杆菌ClpX(ClpX， Rv2457c)属于AAA+ATP酶家族，具有底物识别以及ATP水解活性，可特异性地识别并解聚或重塑靶蛋白；也可与具蛋白水解酶活性的ClpP结合形成ClpXP异源二聚体，特异性地降解目的蛋白[4-7].ClpX是结核杆菌存活与致病所必需，感染宿主后，ClpX下调自身细胞分裂蛋白FtsZ的活性，参与调控结核杆菌自身的细胞分裂[8]].此外，作为细胞膜组分[9-11]，ClpX也可能参与结核杆菌与宿主的免疫互作，有潜力成为评定结核杆菌毒力的优良靶标.

我们的前期研究中发现结核杆菌来源的ClpX具有抑制宿主细胞增殖的能力，并且利用酵母双杂交技术，在人cDNA文库中筛选到一个能与ClpX直接相互作用的蛋白——UBC9(UBE2I，NM_003345.4，GI：342307071).在本文中，我们将借助分子和细胞生物学方法，尝试评估ClpX对细胞增殖的影响，并探讨其作用于宿主的遗传调控机理.

1 材料与方法

1.1 材料

SfiⅠ限制性内切酶、dNTP Mix购自TaKaRa公司.FastPfu和Taq酶购自北京全式金生物技术有限公司.Ligation High Kit购自TOYOBO公司.Agarose为Biowest公司产品.TRYPTONE，YEAST EXTRACT购自Oxoid公司.Bacto-Agar、Yeast Nitrogen Base购自BD公司.氨基酸混合物Dropout、鲑鱼精ssDNA购自北京博大泰克公司.X-gal、Triton X-100，HEPES，Nodient P-40，IPTG，Tween-20均购自于Amresco公司.氨基-1，2，4-三唑(3-AT)、PEG3350、鼠抗Myc、Flag、GST、6His的单克隆抗体和巯基乙醇，以及FACS流式细胞术染色试剂碘化丙锭(PI)均购自Sigma & Aldrich公司.

GAL4酵母双杂交系统和酵母双杂交人淋巴细胞cDNA文库购自Clontech公司.质粒抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自AXYGEN公司.酵母质粒抽提试剂盒、细胞培养基DMEM、胎牛血清和胰酶Trypsin-EDTA(0.25%)购自上海索莱宝生物科技有限公司.Lipofectamine 2000脂质体购自Invitrogen公司.一次性细胞培养皿购自Corning.PVDF膜、化学发光底物检测试剂(ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate， Cat. No. WBKLS0100)均购自Millipore公司.厚滤纸购自Biorad公司.蛋白酶抑制剂(protease inhibitor cocktail tables， complete EDTA-free)购自Roche.Protein G beads购自GE公司.Glutathione Sepharose 4B购自于Pharmacia Biotech公司.鼠抗GAPDH的单克隆抗体购自Abmart公司.HRP交联的兔抗鼠二抗购自Rockland公司.X光片为Kodak公司产品.蛋白预染分子量标准为Thermo Scientific公司产品.双荧光素酶报告系统检测试剂盒是Promega公司产品.其他实验所用试剂均为进口或国产分析纯.表1为实验中所用引物列表.

表1 实验所用引物

1.2 细胞培养和转染

HEK293T细胞在DMEM+10% FBS培养液中培养.每隔2～3d换一次新鲜培养液.当细胞的铺满率达到70%以上后，用0.25%胰酶消化，传代继续培养.

细胞的瞬时转染：细胞计数后接种于细胞培养皿内，培养18～24h.当细胞的铺满率达到70%后，用Lipofectamine 2000脂质体转染，37℃，5% CO2培养24～72h收细胞.

1.3 流式细胞术检测细胞周期

该实验每一实验组均设置3个重复，同时设置对照组，每个样品检测细胞数目约为10000个.为防止实验时产生大量的细胞碎片，所有细胞经0.25%胰酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，离心收集细胞，用PBS(1.38mmol/L NaCl，0.027mmol/L KCl，0.01mmol/L Na2HPO4，0.018mmol/L KH2PO4，pH 7.4)清洗一遍，加入预冷的70%乙醇固定细胞，用0.1% FCS的PBS洗涤3次，用1mL含20μg/mL PI的PBS重悬细胞，室温避光放置20min，500目(28μm)筛过滤至流式管中，标记，流式细胞仪(BD FACS Calibur)检测细胞DNA情况，Flowjo 7.6软件分析细胞周期.

1.4 酵母双杂交实验

构建诱饵质粒pGBKT7-ClpX并转化入酵母受体菌AH109，经对酵母转化子检测无自激活反应后，将其制备成酵母转化感受态细胞.用化学转化方法将pACT2-淋巴细胞cDNA文库质粒转入已含有诱饵质粒的酵母感受态细胞，涂布SD-Leu-Trp-His+5 mM 3AT(SD-3)平板，30℃培养2～3d，用无菌绒布对SD-3平板上长出的转化子进行影印清除后，继续培养至阳性菌落长出.将阳性菌落分别转接到SD-Leu-Trp(SD-2)和SD-Leu-Trp-His-Ade(SD-4)平板上进行培养，以检测HIS3和ADE2报告基因是否被激活.同时将阳性菌落接种于后滤纸上，液氮冷冻处理后将滤纸放入含有X-Gal的Z Buffer中检测LacZ报告基因的激活情况.挑取能同时激活HIS3、ADE2和LacZ3个报告基因的阳性菌落，抽提酵母阳性克隆质粒并转化大肠杆菌扩增，对阳性克隆质粒DNA测序及BLAST分析.最后将筛选到的阳性克隆质粒与诱饵质粒共转化酵母细胞，再次检测对上述3个报告基因的激活情况，以确认两者的蛋白相互作用.

1.5 GST pull-down体外结合实验

构建pGEX-5x-1-UBC9和pET-28a-ClpX表达载体，分别转化E.coliBL21(DE3)以表达GST-UBC9以及6His-ClpX融合蛋白.同时转化pGEX-5x-1和pET-28a空载体作为阴性对照.

GST pull-down：将结合有GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B悬浮于500μL NETN(100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl pH 7.0，0.5% Nonidet P-40，1mmol/L PMSF)缓冲液中，加入50μL纯化的6His-ClpX融合蛋白，于4℃结合4～8h.离心后沉淀用500μL buffer H(20mmol/L Tris-HCl pH 7.7，50mmol/L KCl，20% Glycerol，0.1% Nonidet P-40，0.007%β-巯基乙醇)洗涤3次.在沉淀中加入20μL 1×SDS蛋白上样缓冲液，在沸水浴中变性5min，离心后取上清作SDS-PAGE凝胶电泳.以mouse Anti-His的单克隆抗体进行Western blot检测.

1.6 体内结合实验(Co-IP)

将pCMV-Myc-ClpX和pEF-Flag-UBC9两个重组质粒瞬时共转染到HEK293T细胞中.转染48h后收集细胞，加入1mL细胞裂解液(150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCL，1% NP-40，1mmol/L DTT，5mmol/L EDTA，使用前加入蛋白酶抑制剂)，4℃裂解1h，从中预留10μL加入2×蛋白电泳上样缓冲液作为阳性对照，其余细胞裂解液平均分成2份，其中1份样品中加入Myc标签抗体1μg，另1份样品中加入mouse IgG 1μg作为阴性对照，将两个样品同时在4℃水平摇床上低速摇动过夜，次日向每个样品中各加入20μL protein G琼脂糖凝珠，4℃水平摇床上低速摇动6～8h，离心后吸去上清，用细胞裂解液洗涤琼脂糖凝珠抗原抗体复合物3次，吸干珠子上方的水层后，加入20μL 1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴5min，离心后对上清用Flag抗体进行Western blot检测.

1.7 细胞增殖检测

将构建好的重组质粒瞬时转染HEK293T细胞，转染18h后充分消化细胞，稀释后种入96孔板内.使用与酶标仪匹配的96孔板按照每孔1000个细胞(培液100μL)计算细胞总量，并按照测量天数作为所分细胞孔数的倍数，每组设3个重复.待3h左右细胞基本贴壁后每孔加入10μL MTT显色剂(5mg/mL)进行显色反应，在37℃，5% CO2的培养箱内继续孵育4h后，吸出培养基，在每孔中加入100μL DMSO，振荡混合10min，使蓝紫色沉淀充分溶解，在490nm测定吸光值，以确定细胞实际的起始密度，作为生长相对零点.按照同样的方法每隔24h测量一次，连续测定3～4d.等所有数据收集后，用Excel绘出图表.

1.8 萤光素酶信号检测

Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)活性的一种报告系统，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法.本实验所用的Luciferase报告基因质粒中含有5个拷贝的NF-κB(Nuclear Factor κB)应答元件，可与NF-κB转录因子相互作用而激活萤光素酶报告基因luc2P的转录，通过测定萤光素酶的表达量来检测对应转录因子的活性.

接种细胞至24孔板培养过夜，将3种质粒按照一定的比例共转染细胞(目的基因质粒或空载体对照质粒，600ng；Luciferase报告基因质粒，100ng；Renilla质粒，10ng)，37℃，5% CO2，继续培养24～48h后，用PBS洗涤1次，每孔加100μL 1×PLB细胞裂解液，室温振荡裂解15min后把裂解液吸入1.5mL的离心管中，离心取上清.

Luciferase检测分析：按照Promega公司Dual Luciferase reporter assay system操作手册进行操作，用Promega公司的发光检测仪上机检测；每个检测孔(96孔板)内加入20μL细胞裂解液上清，先在每孔添加100μL LARⅡ测定Firefly Luciferase活性，再添加100μL Stop&Glo试剂，以测定Renilla Luciferase活性.每个样品做3个重复孔，用Excel软件绘制柱形图，分析实验结果.

2 结果与分析

2.1 ClpX抑制宿主细胞增殖

为了检测ClpX对宿主细胞增殖的影响，我们将pCMV-Myc-ClpX质粒转染HEK293T细胞使其进行过表达，并利用MTT法检测细胞的生长速率.结果显示，与转染pCMV-Myc空质粒的阴性对照相比，过表达ClpX会显著减缓细胞的增殖(图1(a)).经过24，48和72h培养后，过表达ClpX的HEK293T细胞数量分别只有对照组的96.0%(P=3.0×10-2)，92.3%(P=3.5×10-4)和85.2%(P=5.7×10-6).

我们随后对该组细胞进行了流式细胞仪检测，以观察ClpX对细胞周期的影响.结果表明，与对照相比，在过表达ClpX的HEK293T细胞中，处于G2期细胞的比例由10.57%上升至14.35%(P=3.7×10-2)，见图1(b)，提示ClpX的表达会导致HEK293T细胞G2期阻滞，并可能因此抑制细胞增殖.

2.2 ClpX与人UBC9间存在直接相互作用

为探索结核分枝杆菌在感染宿主并激活免疫反应的过程中，作为病原体的蛋白酶亚基ClpX是否有可能通过与宿主蛋白间的直接相互作用而行使激活免疫系统的分子功能.我们采用酵母双杂交技术，以ClpX为诱饵蛋白(bait)筛选人类免疫淋巴细胞文库，以期获得人类细胞中能够与ClpX直接相互作用的蛋白.通过酵母双杂交文库筛选获得2个阳性克隆，经BLAST比对分析发现均编码同一蛋白，人UBC9.经过进一步的回转验证实验，结果显示构建在酵母双杂交猎物(prey)载体pGADT7上的UBC9与构建在诱饵载体pGBKT7上的ClpX共转化酵母菌株AH109后能有效激活报告中全部3个报告基因ADE2、HIS3和LacZ，且并未检测到UBC9存在自激活效应，证实ClpX与UBC9这两个蛋白之间存在直接的物理相互作用(图2(b)).

为了进一步检验ClpX与UBC9两者间的相互作用，我们进行了体外GST pull-down实验，并证实经原核表达的6His-ClpX与GST-UBC9融合蛋白间在体外也能发生直接的相互作用(图2(b)).同时，为了检验这两个蛋白在宿主细胞内是否存在相互作用，我们又在HEK293T细胞内进行了免疫共沉淀实验.结果显示利用Anti-Myc抗体能够共沉淀Flag-UBC9，使其可被Anti-Flag抗体检测(图2(c)).以上这些结果均证实了ClpX与UBC9蛋白之间存在直接的物理相互作用，ClpX也因此有可能通过UBC9调控人类细胞.

2.3 ClpX下调内源性UBC9蛋白表达

我们在进行上述Co-IP实验中意外发现，相较于单独过表达UBC9，同时过表达ClpX和UBC9时，UBC9过表达水平显著下调(图3).结合ClpX编码蛋白水解酶这一信息，我们推测ClpX能够通过物理结合UBC9并下调其蛋白表达.为了验证这一假设，我们分别在转染了pCMV-Myc-ClpX(过表达ClpX)和pCMV-Myc空载体(空白对照)的HEK293T细胞中，使用Western blot检测细胞内源性UBC9的表达量，实验结果如图3所示：过表达ClpX后，细胞内源性UBC9表达量显著下调，从而验证了我们的推测.

2.4 ClpX通过UBC9调控细胞增殖

作为细胞中唯一参与SUMO化(SUMOylation)的泛素接合酶E2，UBC9在SUMO化修饰介导的细胞通路中行使重要功能，参与调控细胞生长，肿瘤发生等生物过程.为了检测ClpX是否也能通过下调UBC9的蛋白表达抑制细胞增殖，我们使用人工合成的shRNA沉默细胞内源性UBC9的蛋白.在HEK293T细胞中，sh205，sh317两条识别不同靶序列的shRNA被证明能够有效地下调内源性UBC9的表达(图4(a)，见第592页).且我们发现沉默UBC9和过表达ClpX的HEK293T细胞表现相同，细胞增殖被显著抑制，并表现出明显的G2期阻滞(图4(b)～(d)).此外，在过表达ClpX的HEK293T细胞中，如果同时过表达UBC9能够显著逆转因ClpX过表达引起的细胞增殖抑制现象(图4(e)).这些结果均提示ClpX调控细胞增殖依赖与UBC9的相互作用.

2.5 过表达结核杆菌ClpX增强NF-κB转录因子活性

结核杆菌感染能够激活宿主的免疫系统，Toll样受体(TLRs)介导最初的细胞免疫激活反应，发挥杀伤最初侵入的结核杆菌的功能.TLRs能够激活转录因子NF-κB，因此调控细胞内免疫反应依赖的一系列免疫调节因子(如IL8、IL-1β、TNF-α、Bcl-2等)的表达，最终杀灭侵入体内的结核杆菌[2，12-13].在以上工作中我们发现了ClpX与UBC9在细胞内存在特异性相互作用，并且ClpX可抑制宿主细胞UBC9的表达，并因此抑制宿主细胞的增殖.已知UBC9作为SUMO化修饰的关键酶之一，能通过参与SUMO化过程而可逆的调节多种转录因子进出细胞核的行为及转录活性.为探究结核杆菌ClpX蛋白进入细胞后宿主的NF-κB转录因子能否响应，我们采用双萤光素酶报告系统检测了过表达ClpX后HEK293T细胞中内源性NF-κB转录因子的活性.结果显示，相较于转染了pCMV-Myc空载体的对照组细胞，转染了pCMV-Myc-ClpX(过表达ClpX)的实验组中NF-κB转录因子活性显著增强(图5).

3 讨 论

病原微生物与宿主细胞间复杂的相互作用是感染性疾病发生的基础.感染发生后，微生物及宿主细胞的多种信号传导途径以及基因表达谱常会发生巨大变异，从而激活细胞内的一系列免疫应答反应，引起细胞增殖、分化、炎症、凋亡等生物过程的异常，进而引发疾病[13].而病原微生物的分泌蛋白及细胞表面组分在这一过程中起着至关重要的作用.质谱分析显示，结核杆菌H37Rv的ClpX蛋白存在于膜蛋白碎片和全细胞裂解液[9-11]，这提示，作为结核杆菌细胞膜组分的ClpX可能在侵染宿主细胞、与宿主的免疫互作以及在宿主细胞中长期潜伏和持留的过程中产生影响.

ClpX在原核生物中高度保守，除经典的模式生物大肠杆菌(Escherichiacoli)外，伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、痢疾杆菌(Shigelladysenteriae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)等致病菌中均存在高度保守的ClpX(identity>60%).尤其在约151～225位的氨基酸残基，AAA+(ATPases Associated with a wide variety of cellular Activities)功能结构域所处的位置，一致性超过75%(图6)，蛋白结构的高度相似性暗示结核杆菌与近源种间的ClpX分子功能具有保守性.研究表明，在大肠杆菌中过量表达结核杆菌的ClpX会抑制宿主菌的生长速度[3]，此外，在结核杆菌自身体内过量表达ClpX也会延迟菌体的生长和分裂[8].本文的研究发现了ClpX能够直接结合人源UBC9进而下调其蛋白表达水平，这直接阻滞了宿主的细胞周期并表现为细胞增殖缓慢.

UBC9是细胞内介导蛋白质泛素化降解的接合酶(E2)之一，可通过调节蛋白质的降解而调控细胞内的多种生物学过程.UBC9也是至今发现的唯一一个能参与SUMO化修饰的E2，因此在SUMO化修饰介导的细胞通路中行使着重要功能.大量研究发现，肿瘤细胞中UBC9表达量升高，如果人为抑制UBC9的表达就能抑制肿瘤细胞的增殖[14-15].SUMO化修饰能可逆的调节转录因子进出细胞核的行为及转录活性，全局调控细胞蛋白质组，从而控制细胞周期、基因表达及DNA合成等最基础的生命活动[16].因此，我们推测结核杆菌ClpX下调UBC9对宿主细胞的影响并不仅限于抑制细胞增殖，还应调控其他基础的细胞功能，影响多种细胞内的信号通路.NF-κB转录因子调控的信号通路在宿主对多种病原微生物感染所激发的免疫应答反应(包括先天性免疫和获得性免疫)中都具有重要作用[13].PARP1、PIAS-gamma和UBC9共同参与的SUMO化修饰可以调节NEMO亚基(IKKγ， NF-κB必需的调节亚基)的进出核反应[17]，因此UBC9表达量的变化势必会影响到NF-κB转录因子的活性及其所调控的信号转导通路的进程.

本研究证实了结核杆菌ClpX可与人源UBC9蛋白发生直接的物理相互作用，激活NF-κB转录因子的活性.由于被激活的NF-κB转录因子可上调下游编码基因的表达量，包括一系列趋化因子(Chemokine)、细胞因子(cytokines， CK)、粘附分子(Adhesion Molecules， AMs)、促进炎症反应(inflammatory)的酶类、凋亡抑制因子(inhibitors of apoptosis)等，因此这些成分可以促进宿主被病原体感染的部位产生炎症，使吞噬细胞呈递至感染部位，对病原体进行吞噬[13]，同时，NF-κB的激活在多种细胞中都可以阻断TNF诱导的细胞凋亡[18-19].病原体在最初入侵宿主细胞时对宿主细胞产生的先天性免疫反应的调节在建立早期的感染、长期的持留和潜伏中都起重要作用[20].因此，结核杆菌ClpX可能是一种保守的毒力因子，通过与UBC9的蛋白相互作用，调控SUMO化修饰所参与的相关信号通路.其中包括激活宿主NF-κB转录因子活性从而激发宿主的先天性免疫应答反应，实现对宿主的侵染以及在巨噬细胞中的持留.本文对于结核杆菌ClpX所引起的宿主表型与功能的变异，以及宿主响应ClpX表达的相关信号通路的研究结果，为进一步深入研究结核杆菌及其近源的病原微生物与宿主之间相互作用的机理提供了新的线索.

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Mycobacterium tuberculosis ClpX Interacts with Human UBC9 and Inhibits the Proliferation of Host Cell

WANG Yaqian， SHI Chao， HUO Keke

(State Key Laboratory of Genetic Engineering， School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China)

ClpXP serine protease is well conserved in prokaryotes， consists of ClpX and ClpP. ClpX with ATP binding and hydrolysis activity， involved in regulation of cell cycle and the stress response， is essential for the pathogenicity in a variety of microorganisms includingMycobacteriumtuberculosis. However， little was known about the underlying molecular basis. In order to reveal the mechanisms of howMycobacteriumtuberculosisworking in the infected host cells through ClpX， we performed a yeast two hybrid screening from human lymphocytes cDNA library to explore new proteins interacting with ClpX. An ubiquitin ligase E2 protein， UBC9 was identified and its specific protein interaction with ClpX was confirmed by GST pull-down and co-IP assay. We next demonstrated that cell proliferation was inhibited in HEK293T cells with overexpressed ClpX protein or silenced UBC9 protein， whilst an overexpressed UBC9 could eliminate the negative regulation of cell proliferation.

Mycobacteriumtuberculosis； ClpX； UBC9； protein interaction； cell proliferation

0427-7104(2016)05-0587-09

2016-02-29

国家重点基础研究发展计划(2013CB531603)；国家科技重大专项(62008ZX10003-006)

王亚倩(1985—)，女，硕士研究生；霍克克，男，教授，通讯联系人，E-mail：kkhuo@fudan.edu.cn

Q 752

A