结核分枝杆菌ICL抑制CTBP1表达并促进细胞凋亡

石 超，王亚倩，邵骏骅，霍克克

(复旦大学 生命科学学院 遗传工程国家重点实验室，上海 200438)



结核分枝杆菌ICL抑制CTBP1表达并促进细胞凋亡

石 超，王亚倩，邵骏骅，霍克克

(复旦大学 生命科学学院 遗传工程国家重点实验室，上海 200438)

异柠檬酸裂合酶(Isocitrate Lyase, ICL)参与乙醛酸循环，是结核分枝杆菌能在宿主体内潜伏的关键因素之一.为了探索ICL在结核菌与宿主相互作用中的地位，首先通过酵母双杂交技术在人淋巴细胞cDNA文库中筛选得到一个新的ICL相互作用蛋白CTBP1(C Terminal Binding Protein 1).然后分别采用GST pull-down和Co-IP实验证实了这两个蛋白在体外和体内与ICL相互作用的特异性.通过使ICL在HEK293T细胞中过表达，发现内源性CTBP1在转录水平和蛋白水平的表达都受到了抑制，同时导致细胞增殖减缓、凋亡加快，并出现G2/M期阻滞等改变.这些结果表明，结核菌ICL在参与介导细胞凋亡、影响宿主细胞活性的过程中起着重要的作用.

结核分枝杆菌； ICL； CTBP1； 蛋白质相互作用； 细胞凋亡

结核病(Tuberculosis)是严重威胁人类健康的三大传染病之一，虽然抗生素的发现一度抑制了结核病的蔓延，但耐单药、耐多药和泛耐药结核菌的出现，让它重新成为当代医学的一个巨大挑战[1]，它的耐药性转变也成为科研人员的重点研究对象[2].结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)(简称结核菌)是结核病的致病菌.结核菌的特点之一在于它感染宿主之后能成功逃避宿主的免疫攻击，能以持续感染或休眠状态继续存活，当宿主免疫功能下降时，潜伏的病菌就可能被重新激活，发展成为活动性结核病[3].

结核菌在感染宿主初期被巨噬细胞吞噬，其所处的生存环境极端恶劣——低养分，低氧，低pH环境，存在各种抗菌物质.随着糖分的消耗，结核菌的三羧酸循环下调，产能下降.此时，乙醛酸循环就可以作为一种回补途径为结核菌继续提供能量[4].脂肪酸经过β-氧化分解为乙酰CoA，乙酰CoA进入乙醛酸循环，生成了草酰乙酸和琥珀酸，这一过程可以为三羧酸循环补充一些中间产物.三羧酸循环的产能原料是糖，而乙醛酸循环则用脂肪酸替代，这就为结核菌在不利的细胞环境中生存提供了可能.

异柠檬酸裂合酶(Isocitrate Lyase, ICL)是乙醛酸循环中第一个关键酶，能够催化异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸.前人的研究表明，当三羧酸循环被抑制时，如果ICL也被抑制，结核菌就很难继续存活[5].在结核菌感染过程中，其ICL基因的mRNA表达上调[6].研究人员在小鼠的肺部、人类的肺部肉芽肿和坏死肉芽肿的淋巴细胞区发现，ICL的mRNA大幅增加[7].还有研究发现，结核菌的PhoP突变株的毒性变弱，但依旧持留在受感染小鼠体内，因为这个突变株有更高的ICL表达水平[8].同时，ICL也可能是结核菌对抗生素产生耐药性的重要因素[9].这些研究结果都提示ICL对结核菌持续感染宿主具有重要的意义，但是其作用机制仍未完全清楚.

为了研究ICL在结核菌持续感染宿主细胞过程中的作用机理，本文以ICL为诱饵，通过酵母双杂交方法筛选人淋巴细胞cDNA文库，得到若干与之发生相互作用的蛋白，其中CTBP1(C Terminal Binding Protein 1)引起了我们的关注，CTBP1作为转录辅助因子在机体细胞生长发育过程中发挥着重要的作用.本文对结核菌ICL和宿主细胞CTBP1的相互作用及其对细胞功能的影响进行了初步的探讨.

1 材料与方法

1.1 材料

SfiⅠ限制性内切酶和dNTP Mix购自TaKaRa 公司.Ligation High购自TOYOBO公司.EasyTaq DNA Ploymerase，EasyPfu DNA Ploymerase购自北京全式金公司.3-氨基-1，2，4-三唑(3-AT)，PEG3350购自Sigma 公司.X-gal，HEPES，Nodient P-40，IPTG，PMSF 为 Amresco 公司产品.蛋白酶抑制剂(protease inhibitor cocktail tables, complete EDTA-free)购自Roche公司.PVDF膜和化学发光底物检测试剂购自Millipore公司.Opti-MEM购自Gibco公司.Lipofectamine 2000脂质体和TRIzol购自Invitrogen 公司.

Protein G beads购自GE公司.Glutathione Sepharose 4B 购自Pharmacia Biotech 公司.Ni-NTA Agrose珠子购自Qiagen公司.鼠抗Myc和鼠抗Flag的单克隆抗体是北京全式金公司产品.鼠抗 GAPDH 的单克隆抗体购自Abmart公司.鼠抗GFP的单克隆抗体，兔抗 CTBP1 的单克隆抗体，HRP 交联的羊抗兔二抗购自ProteinTech公司.HRP 交联的兔抗鼠二抗购自Rockland 公司.逆转录系统购自 Promega 公司.DMEM，FBS和ANNEXIN-FITC/PI凋亡试剂盒均购自上海索莱宝公司.

GAL4酵母双杂交系统和人淋巴细胞cDNA 文库购自Clontech 公司.原核细胞表达载体 pGEX-5x-1 来自 Pharmacia Biotech，pET-28a来自 Novagen 公司；哺乳动物表达载体 pEF-Flag 和 pCMV-Myc 购自Invitrogen公司，pEGFP-C1、pDsRed-C1载体购自 Clontech 公司.用于转化的大肠杆菌菌株 TOP10 和表达菌株BL21(DE3)，哺乳动物细胞系 HEK293T 细胞株均为本实验室保存.引物由上海杰李公司合成.

1.2 酵母双杂交筛选和回转验证

本实验采用Clontech公司的GAL4酵母双杂交系统.将ICL基因构建到诱饵载体pGBKT7，并对pGBKT7-ICL进行自激活检测，步骤为：将AH109酵母菌接种到YPD培养基，30℃震荡过夜，次日转接种子液到新的培养基，震荡活化，直至OD600到0.6；离心收集菌体，用无菌水洗涤1次，0.1mol/L的LiAc洗涤2次，而后每个转化依次加入240μL 50% PEG3350、36μL 1mol/L LiAc、5μL ssDNA(10 mg/mL)、1μg pGBKT7-ICL质粒，完全混匀后进行水浴，30℃水浴30min，42℃水浴25min，30℃水浴1 h，离心收集菌体，用无菌水重悬混匀后涂布相应的缺陷平板；30℃恒温培养3d，然后检测ADE2、HIS3和LacZ报告基因的活性.

通过自激活检测后，对转入了pGBKT7-ICL质粒的AH109酵母菌进行培养，接入培养基并震荡过夜，次日转接活化；洗涤并收集菌体，再向收集的菌体中依次加入9.6mL 50% PEG3350、1440μL 1mol/L LiAc、200μL预变性的ssDNA、20μg人淋巴细胞文库质粒，完全混匀并水浴，最后用6～7mL无菌水重悬，混匀后涂布效率平板和缺陷平板；30℃恒温培养3d，检测ADE2、HIS3和LacZ报告基因的活性，得到阳性克隆；抽提阳性克隆的酵母质粒，测序并进行BLAST比对，找到相关基因信息.回转验证时，选择筛库得到的“猎物基因”与诱饵克隆质粒共转化酵母，检测报告基因被激活的情况验证两者之间的相互作用.

1.3 GST pull-down实验

将ICL克隆构建到原核表达载体pGEX-5x-1得到pGEX-5x-1-ICL，CTBP1克隆构建到pET-28a载体得到pET-28a-CTBP1，以pGEX-5x-1空载体质粒为对照，分别转化大肠杆菌BL21(DE3).将转化子单菌落分别接种在含0.2mmol/L IPTG的LB培养基中，在30℃诱导培养4h，离心收集菌体.分离GST融合蛋白用PBS重悬，分离His融合蛋白用裂解缓冲液(50mmol/L sodium phosphate，300mmol/L NaCl，10mmol/L imidazole，pH 8.0)悬浮，超声破碎细胞壁取上清，破壁前加入PMSF和蛋白酶抑制剂, 破壁后立即加入20% Triton X-100，并在冰上放置 30min.用Glutathione Sepharose 4B珠子结合沉淀细胞裂解液上清中的GST融合蛋白；用Ni-NTA珠子结合裂解液上清中的His融合蛋白，并用200μL洗涤缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 20mmol/L 咪唑, pH 8.0)洗涤珠子3次, 再用60μL 洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 250mmol/L 咪唑, pH 8.0)洗脱得到纯化的His融合蛋白.将结合有GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B悬浮在500μL NETN缓冲液(100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，0.5% NonidetP-40，1mmol/L PMSF)中，加入50μL纯化好的His融合蛋白，4℃结合过夜，沉淀用Buffer H(20mmol/L HEPES，50mmol/L KCl，20% Glycerol，0.1% Nonidet P-40，0.007%β-巯基乙醇)洗涤3次.最终沉淀用anti-His单克隆抗体进行Western blot检测.

1.4 免疫共沉淀实验

分别构建哺乳动物表达重组质粒pEGFP-ICL和pCMV-Myc-CTBP1，将这2个重组质粒共转HEK293T细胞株，同时以pEGFP-ICL和pCMV-Myc空载体共转染的细胞作为阴性对照.转染后在含10% FBS的DMEM培养液中37℃培养24h，收获并裂解细胞，在裂解上清中加入Protein G Agarose亲和凝胶珠子，混匀后震荡1h进行预沉淀，而后取上清加入2μg anti-Myc抗体，4℃震荡1h后再加入Protein G Agarose亲和凝胶珠子在4℃震荡过夜，沉淀用anti-GFP和anti-Myc的单克隆抗体进行Western blot检测.

1.5 细胞内基因表达检测

将pEGFP-ICL质粒转染至HEK293T细胞，培养24～48h后用PBS洗涤，加入TRIzol 1mL，静置15min后吹匀收集细胞，漩涡震荡混匀.加入 0.2mL三氯甲烷，剧烈摇动10 s，室温放置1min.4℃离心收集上清，转移至另一新的RNase-free离心管中，并加入等体积的无水乙醇，转入带有2mL收集管的mini-spin 离心柱，室温离心洗涤2次，将离心柱转移至一新的1.5mL RNase-free离心管中，用适量DEPC水洗脱收集总RNA.

将1μg 总 RNA 加入微量离心管中并于70℃温育10min，短暂离心后置于冰上，选用逆转录引物建立反转录体系，42℃温育30min，85℃加热10min.每个样品取2μL作为模板，以待测基因的 RT-PCR专用引物为引物，在实时荧光定量 PCR 仪中进行反应，每个基因进行 3个平行反应，并使用 GAPDH 作为内对照，相对定量地检测CTBP1基因的表达情况.

1.6 流式细胞仪测定细胞周期

HEK293T细胞转染24～48h后收获，用PBS洗1次，并用PBS重悬制成单细胞悬液，快速加入-20℃ 预冷的75%乙醇，4℃固定1h或-20℃固定过夜.固定好的细胞用含0.1% FBS的PBS洗涤3次，得到的细胞沉淀用含50μg/mL的PI和50μg/mL的RNase A的PBS重悬，室温避光反应20min.200目(约74μm)尼龙网过滤，上机(FACS Calibur, Becton-Dickinson)做细胞周期检测.

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡

HEK293T细胞转染24～48h后用EDTA-free的胰酶消化，用PBS洗涤2次，加入200μL的Binding Buffer悬浮细胞，再加入10μL Annexin V-FITC和10μL PI，混合均匀，室温避光反应15min，1h 内上流式细胞仪做凋亡检测.

1.8 细胞生长曲线实验

细胞转染24h后，按每孔2000个细胞(培液200μL)转接到96孔板；每个检测样本设置4～7个检测组，每个检测组设6个重复孔.待3h左右细胞基本贴壁后观察细胞状态和数目，舍去明显不与Control同步的重复孔，然后用显色剂显色反应，以后每隔24h重复显色实验，持续4～7d.显色剂显色反应：每孔加20μL MTT Stock，继续孵育4h后，吸出培养基，每孔加入100μL DMSO，待结晶完全溶解后用酶标仪测定490 nm处的吸光度值.

2 结 果

2.1 酵母双杂交检测ICL与CTBP1的相互作用

本文采用Clontech酵母双杂交系统，对ICL的相互作用蛋白进行了筛选.首先，通过自激活检测确定诱饵克隆质粒pGBKT7-ICL不存在自激活，然后用诱饵质粒筛选人淋巴细胞cDNA文库.初筛共得到30个阳性克隆，抽提质粒后测序，经BLAST比对，发现其中有CTBP1基因.将CTBP1的全长编码序列构建到“猎物”载体，得到pGADT7-CTBP1，与pGBKT7-ICL质粒共转酵母菌株AH109进行回转验证.结果显示ICL与CTBP1在酵母体内存在相互作用，可以激活报告基因(图1).

2.2 ICL与CTBP1在体外和体内都存在相互作用

为了排除酵母细胞内其他因素介导产生假阳性的可能，我们采用GST pull-down和Co-IP技术分别验证ICL与CTBP1在体外和体内条件下的相互作用.

用GST pull-down技术进行体外验证时，构建pGEX-5x-1-ICL和pET28a-CTBP1两个原核表达质粒，分别转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达并获得纯化的融合蛋白.将纯化好的蛋白进行体外结合，用anti-His抗体进行Western blot检测，结果如图2所示.GST-ICL存在时能检测到6×His-CTBP1蛋白的条带，而仅有GST蛋白时，无法检测到到6×His-CTBP1，这表明ICL与CTBP1在体外存在特异性的相互作用.用Co-IP技术检测ICL与CTBP1在细胞环境中的相互作用时，构建真核表达质粒pEGFP-ICL和pCMV-Myc-CTBP1，并将pEGFP-ICL分别与pCMV-Myc-CTBP1或与pCMV-Myc空载体共转染HEK293T细胞，进行免疫共沉淀实验.结果显示，结合有Myc-CTBP1的凝胶珠子可以将GFP-ICL免疫共沉淀下来，并被anti-GFP抗体检测到(图3，泳道1)；而只结合了Myc蛋白的凝胶珠子则无法将GFP-ICL免疫共沉淀下来(图3，泳道2).这表明ICL与CTBP1确实可以在细胞内发生特异性的蛋白间的直接相互作用.

2.3 ICL抑制内源CTBP1的表达

为了研究结核菌ICL与宿主CTBP1蛋白相互作用的生物学意义，我们首先分析了ICL表达对宿主内源CTBP1表达的影响.通过使用不同剂量的pEGFP-ICL质粒DNA转染HEK293T细胞，然后抽提转染细胞的总RNA进行实时定量RT-PCR实验，检测细胞内CTBP1基因的表达变化，结果如图4(见第600页)所示.随着ICL表达量的增加，在一定程度上降低了内源CTBP1的mRNA表达水平.

进而，我们又分析了ICL对内源CTBP1蛋白表达的影响.通过检测不同剂量pEGFP-ICL质粒转染的HEK293T细胞内GFP-ICL蛋白和内源CTBP1蛋白的表达情况，发现随着ICL表达量的增加，GFP-ICL融合蛋白的表达水平也相应提高，但内源CTBP1蛋白表达量却逐渐减少(图5，见第600页).这一现象提示，ICL的表达可降低内源CTBP1的蛋白水平，降低的程度与ICL的表达水平密切相关.两个实验的结果提示，结核菌ICL对宿主CTBP1在转录和翻译水平上都有抑制作用，但更多地是表现在翻译水平上的抑制.

2.4 CTBP1的过表达及Knock-down细胞株的构建

为了观察ICL与CTBP1相互作用对细胞的影响，首先需要构建CTBP1的过表达细胞株和低表达细胞株.我们用不同剂量的pCMV-Myc-CTBP1质粒转染HEK293T细胞作为CTBP1的过表达实验组，结果显示转染不同剂量的pCMV-Myc-CTBP1质粒均可以实现CTBP1的高水平表达(图6(a)).

同时，用4条针对CTBP1基因的shRNA质粒分别等量转入HEK293T细胞作为CTBP1的低表达组，利用抗CTBP1抗体检测转染细胞内CTBP1的蛋白表达水平.结果可见每条shRNA都对CTBP1基因的表达产生了一定抑制，其中shRNA95的抑制效果最明显(图6(b)).因此，在后续的实验中均以转染shRNA95的细胞作为CTBP1的低表达株.

2.5 ICL与CTBP1的相互作用抑制细胞增殖

为了研究ICL与CTBP1相互作用对细胞的生物学效应，我们用MTT法分别检测了ICL过表达组、CTBP1高表达组和CTBP1低表达组的细胞增殖情况.细胞转染后转接到96孔板，完成显色反应并测得490 nm处的吸光度值，共测定0h，24h，48h和72h 4个时间点的数据.实验结果显示，结核菌ICL过表达组的细胞增殖受到抑制(图7(a))，CTBP1高表达组的细胞增殖加快(图7(b))，而被RNA干扰后的CTBP1低表达组细胞增殖减缓(图7(c)).结合2.3节的结果，提示ICL在细胞内对CTBP1的表达有抑制作用，而两者的互作可抑制细胞增殖.

2.6 ICL与CTBP1的相互作用导致细胞G2/M期阻滞

为了分析ICL与CTBP1相互作用对细胞周期的影响，我们又利用流式细胞仪对ICL过表达组、CTBP1高表达组和CTBP1低表达组进行了细胞周期检测，通过FlowJo 7.6软件分析，统计各实验组处于不同细胞时期的频率(图8).

结果显示，与对照组相比，过表达ICL组的G2/M期细胞增多(12.93%→22.28%，P=6.5×10-4)(图8(a))；CTBP1高表达组的G2/M期频率减小(22.09%→12.58%，P=1.5×10-2)(图8(b))；被RNA干扰后的CTBP1低表达组与过表达ICL组的情况相似，也是G2/M期细胞的比率增多(8.97%→20.74%，P=7.9×10-4)(图8(c)).这些结果提示，ICL与CTBP1的相互作用在一定程度上导致了细胞G2/M期的阻滞.

2.7 ICL与CTBP1的相互作用促进细胞凋亡

由于细胞的G2/M期是DNA合成后期，在G2/M期发生阻滞，表明DNA受到损伤或是复制出现了问题，因此细胞就会停留在这个时期对DNA进行损伤修复；如果DNA损伤和复制的问题无法解决，细胞就可能启动凋亡程序.

为了检测细胞周期变化后细胞凋亡情况的变化，我们使用Annexin V：PI 双染色法进行凋亡检测，结果如图9所示.ICL过表达会增加细胞的凋亡率(7.05%→10.99%，P=2.0×10-2)；CTBP1高表达会降低凋亡率(10.82%→5.63%，P=8.8×10-3)；CTBP1低表达会增加凋亡率(6.68%→14.72%，P=2.1×10-3).第一组ICL过表达和第三组CTBP1低表达的实验结果一致，都是加速细胞凋亡.这个结果进一步印证了2.5节的结果，即ICL与CTBP1的相互作用会加快细胞凋亡，从而表现出细胞增殖减缓的现象.

3 讨 论

本文利用结核菌的ICL为诱饵筛选人淋巴细胞cDNA酵母双杂交文库时，发现ICL与CTBP1的蛋白相互作用，并通过GST pull-down和Co-IP实验，验证了它们在体外和体内相互作用的特异性. ICL作为乙醛酸循环的关键代谢酶，常见于微生物和高等植物中，但未曾在哺乳动物体内发现，因此从理论上来说，ICL的靶向药物对人体毒副作用较低[10].自2000年结核菌ICL的晶体结构被解析以来，针对ICL的研究有很大进展，科研人员发现了ICL对结核菌持续感染的影响[5-8]，并以ICL作为药物靶标筛选出大量的潜在抑制剂[11].

CTBP1蛋白属于CTBP蛋白家族，该蛋白家族在发育过程中和成熟组织中广泛转录和表达.脊椎动物有2个CTBP基因，分别是CTBP1和CTBP2，CTBP1和CTBP2联系紧密，且在进化上高度保守.CTBP1通过RNA的差异性剪接得到CTBP1-L和CTBP1-S两种蛋白；CTBP2则通过选择不同的启动子转录并编码CtBP2-L、CtBP2-S和 RIBEYE 3种蛋白[12].CTBP蛋白分布在细胞质和细胞核中，根据CTBP在细胞内的不同定位，其功能也存在差异.在细胞质中，CTBP1与有丝分裂过程中的中心体变化有关[13]，CTBP1-S参与高尔基体的分裂[14]，而CTBP1与RIBEYE对中枢神经系统中的带状突触及传统化学突触的形成有重大影响[15-16].在细胞核中，CTBP蛋白家族最为人知的功能就是作为转录辅抑制因子调控与DNA特异性结合的转录抑制因子，从而调控基因的转录活性[17-18].

在机体层面，CTBP被发现和肿瘤发生与发展密切相关[19-20].CTBP在肝细胞癌中能够介导抑制 E-cadherin 等粘附分子，促进上皮间充质转化(EMT)[21].EMT会促使肿瘤恶化，因为肿瘤细胞间的黏附分子被抑制，使肿瘤细胞获得较高的迁徙、侵袭、抗凋亡能力.同时，CTBP具有拮抗凋亡及“失巢凋亡”(Anoikis)的功能.失巢凋亡是指细胞与细胞外基质或相邻细胞脱离接触后发生的程序性死亡[22].多种肿瘤抑制因子以CTBP蛋白作为靶标，通过介导CTBP蛋白的降解诱导细胞凋亡和/或细胞周期阻滞[23-26].

我们在细胞学实验中发现，当ICL过表达时，细胞内源CTBP1的mRNA和蛋白量都有一定程度的降低，这个结果表明ICL能够抑制CTBP1的表达.在此基础上，我们又通过MTT细胞活性检测、细胞周期和细胞凋亡检测的3组实验，进一步发现在ICL过表达的细胞内，细胞增殖速度明显降低，细胞周期发生了G2/M期阻滞，同时细胞凋亡速度加快.这些结果表明，ICL与CTBP1的蛋白相互作用能够抑制内源CTBP1的表达，从而引发细胞周期阻滞，诱导宿主细胞凋亡.

结核菌侵入宿主后，首先是被巨噬细胞吞噬.结核菌与巨噬细胞之间的相互作用是结核菌在体内生存和发展的关键因素之一.巨噬细胞吞噬结核菌后，会启动TNF-α介导的细胞凋亡.巨噬细胞发生凋亡，清除被吞噬的病菌，防止结核菌在体内扩大感染.而结核菌为了生存则力图抑制巨噬细胞的凋亡，以保护受感染的细胞，为其提供有利于生长和繁殖的空间.当这两者的斗争使巨噬细胞的凋亡达到某种平衡时，活动性结核菌就发展成为潜伏性的结核菌，藏匿在巨噬细胞中，等待“再激活”的时机[27-28].因为结核菌感染与巨噬细胞凋亡之间存在密切联系，而ICL作为结核菌的重要成分之一也对凋亡存在影响，因此以ICL作为切入点，深入研究其对细胞凋亡的影响，将有利于进一步揭示结核菌潜伏感染的机制.

在过去的二十多年中，ICL作为一个抗结核菌药物的潜在靶标受到众多关注.研究人员探究了ICL在基础代谢途径中的作用，并用各种方法筛选出ICL的酶抑制剂，寻找抑制结核菌活性的办法.本文则从结核菌ICL与宿主蛋白相互作用的角度出发，发现了一个新的ICL相互作用蛋白CTBP1，继而通过研究ICL对宿主细胞的影响，发现了ICL能够抑制CTBP1表达并诱导宿主细胞凋亡.本文的研究结果为更深入了解ICL的功能并最终揭示结核菌感染的分子机制提供了新的实验依据.

[1] 朱翠云.结核病流行及其耐药现状 [J].上海医药,2009,30(1)：11-13.

[2] ZHAO M, LI X, XU P,etal. Transmission of MDR and XDR tuberculosis in Shanghai, China [J].PLoSOne,2009,4(2)：e4370.

[3] 王晓珍,王洪海,谢建平.结核分枝杆菌持续感染相关基因及其调控网络分析 [J].中国科学：生命科学,2010，40(10)：909-919.

[4] WAYNE L G, LIN K Y. Glyoxylate metabolism and adaptation ofMycobacteriumtuberculosisto survival under anaerobic conditions [J].InfectImmun,1982,37(3)：1042-1049.

[5] MUNOZ-ELIAS E J, MCKINNEY J D.Mycobacteriumtuberculosisisocitrate lyases 1 and 2 are jointly required forinvivogrowth and virulence [J].NatMed,2005,11(6)：638-644.

[6] TIMM J, POST F A, BEKKER L G,etal. Differential expression of iron-, carbon-, and oxygen-responsive mycobacterial genes in the lungs of chronically infected mice and tuberculosis patients [J].ProcNatlAcadSciUSA,2003,100(24)：14321-14326.

[7] FENHALLS G, STEVENS L, MOSES L,etal. In situ detection ofMycobacteriumtuberculosistranscripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions [J].InfectImmun,2002,70(11)：6330-6338.

[8] GONZALO-ASENSIO J, MOSTOWY S, HARDERS-WESTERVEEN J,etal. PhoP：A missing piece in the intricate puzzle ofMycobacteriumtuberculosisvirulence [J].PLoSOne,2008,3(10)：e3496.

[9] NANDAKUMAR M, NATHAN C, RHEE K Y. Isocitrate lyase mediates broad antibiotic tolerance inMycobacteriumtuberculosis[J].NatCommun,2014,5(5)：4306.

[10] DUNN M F, RAMIREZ-TRUJILLO J A, HERNANDEZ-LUCAS I. Major roles of isocitrate lyase and malate synthase in bacterial and fungal pathogenesis [J].Microbiology,2009,155(155)：3166-3175.

[11] LEE Y V, WAHAB H A, CHOONG Y S. Potential inhibitors for isocitrate lyase ofMycobacteriumtuberculosisandnon-M.tuberculosis：A summary [J].BiomedResInt, 2015, 2015：895453.

[12] CHINNADURAI G. Transcriptional regulation by C-terminal binding proteins [J].InternationalJournalofBiochemistry&CellBiology,2007,39(9)：1593-1607.

[13] SPYER M, ALLDAY M J. The transcriptional co-repressor C-terminal binding protein(CtBP) associates with centrosomes during mitosis [J].CellCycle,2006,5(5)：530-537.

[14] CORDA D, COLANZI A, LUINI A. The multiple activities of CtBP/BARS proteins：The Golgi view [J].TrendsCellBiol,2006,16(3)：167-173.

[15] SCHMITZ F, KONIGSTORFER A, SUDHOF T C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons：A protein’s journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function [J].Neuron,2000,28(3)：857-872.

[16] TOM D S, ALTROCK W D, KESSELS M M,etal. Molecular dissection of the photoreceptor ribbon synapse：physical interaction of Bassoon and RIBEYE is essential for the assembly of the ribbon complex [J].JCellBiol,2005,168(5)：825-836.

[17] TURNER J, CROSSLEY M. The CtBP family：Enigmatic and enzymatic transcriptional co-repressors [J].Bioessays,2001,23(8)：683-690.

[18] CHINNADURAI G. CtBP, an unconventional transcriptional corepressor in development and oncogenesis [J].MolecularCell,2002,9(2)：213-224.

[19] CHINNADURAI G. The transcriptional corepressor CtBP：A foe of multiple tumor suppressors [J].CancerResearch,2009,69(3)：731-734.

[20] WANG R, ASANGANI I A, CHAKRAVARTHI B V,etal. Role of transcriptional corepressor CtBP1 in prostate cancer progression [J].Neoplasia,2012,14(10)：905-908.

[21] ZHANG X L, HUANG C X, ZHANG J,etal. CtBP1 is involved in epithelial-mesenchymal transition and is a potential therapeutic target for hepatocellular carcinoma [J].OncolRep,2013,30(2)：809-814.

[22] GROOTECLAES M L, FRISCH S M. Evidence for a function of CtBP in epithelial gene regulation and anoikis [J].Oncogene,2000,19(33)：3823-3828.

[23] HAMADA F, BIENZ M. The APC tumor suppressor binds to C-terminal binding protein to divert nuclear beta-catenin from TCF [J].DevCell,2004,7(5)：677-685.

[24] NADAULD L D, PHELPS R, MOORE B C,etal. Adenomatous polyposis coli control of C-terminal binding protein-1 stability regulates expression of intestinal retinol dehydrogenases [J].JBiolChem,2006,281(49)：37828-37835.

[25] SIERRA J, YOSHIDA T, JOAZEIRO C A,etal. The APC tumor suppressor counteracts beta-catenin activation and H3K4 methylation at Wnt target genes [J].GenesDev,2006,20(5)：586-600.

[26] ZHANG Q, YOSHIMATSU Y, HILDEBRAND J,etal. Homeodomain interacting protein kinase 2 promotes apoptosis by downregulating the transcriptional corepressor CtBP [J].Cell,2003,115(2)：177-186.

[27] LEE J, HARTMAN M, KORNFELD H. Macrophage apoptosis inMycobacteriumtuberculosis[J].YonseiMedJ,2009,50(1)：1-11.

[28] BEHAR S M, MARTIN C J, BOOTY M G,etal. Apoptosis is an innate defense function of macrophages againstMycobacteriumtuberculosis[J].MucosalImmunology,2011,4(3)：279-287.Mycobacterium tuberculosis ICL Inhibits Expression of CTBP1 and Promotes Cell Apoptosis

SHI Chao, WANG Yaqian, SHAO Junhua, HUO Keke

(State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China)

Lyase isocitrate involves in the glyoxylae cycle, and is one of the key factors that helpMycobacteriumtuberculosisincubate in host cells. In order to explore the effect of ICL on host cells, yeast two hybrid screening was used to screen the cDNA library of Human lymphocyte, and CTBP1 was found to be interacted with ICL. The interaction between ICL and CTBP1 was verified by GST pull-down and Co-IP experiments. In cells with high expression of ICL, endogenous CTBP1 was inhibited on both transcription level and protein level. When CTBP1 was inhibited, the cellular states also changed, as cell proliferation slowed down, cell apoptosis accelerated, G2/M phase blocked. The experimental results showed that ICL can mediate cell apoptosis and affect the activity of host cells. Our results provides new clues to study the mechanism of Mycobacterium tuberculosis’ infection.

Mycobacteriumtuberculosis; ICL; CTBP1; protein interaction; cell apoptosis

0427-7104(2016)05-0596-09

2016-01-07

国家重点基础研究发展计划(2013CB531603)，国家科技重大专项(62008ZX10003-006)

石 超(1989—)，女，硕士研究生；霍克克，男，教授，通讯联系人，E-mail：kkhuo@fudan.edu.cn.

Q 71

A