食管鳞状细胞癌组织中miRNA-375的表达及其临床意义

陆翰杰 任铁军



食管鳞状细胞癌组织中miRNA-375的表达及其临床意义

陆翰杰 任铁军

目的 探讨miRNA-375表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系。方法 通过实时荧光定量PCR，检测miRNA-375在67例食管癌及癌旁正常组织的表达。结果 采用循环阈值(ΔCt)对miRNA-375在食管癌和癌旁正常组织中表达量进行定量分析，食管癌组织ΔCt为9.61±1.52，对应正常组织ΔCt为10.86±1.44，其中有80.6%的食管癌组织其表达量低于癌旁正常组织(2-ΔΔCt<1)。结论 miRNA-375低表达可能与食管鳞状细胞癌的发生、发展、转移相关。

食管鳞状细胞癌；miRNA-375；荧光定量PCR

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1587～1589)

食管癌是世界上最常见的消化道肿瘤之一，死亡率居所有肿瘤中第八位[1]。其发病机制仍然不太清楚，目前认为胃食管反流、抽烟等慢性刺激促进上皮细胞的癌变[2]。尽管近年来食管癌的诊断、治疗都取得不小的进展，但其5年生存率仍小于15%[3]。因此需要寻找更多、更有价值的生物标记物和治疗靶点。

miRNA是1类仅有17～25个核苷酸构成的单链、非编码小RNA分子。它们由RNA聚合酶Ⅱ转录形成茎环样初级miRNA，随后被RNA酶Ⅲ加工成发夹状miRNA前体，在胞质中转换为成熟的miRNA，通过靶向作用于mRNA的3'非翻译区，造成mRNA的翻译抑制或者完全降解[4]。因此，miRNA通过下调靶向mRNA的表达参与肿瘤的增殖、分化、凋亡等过程。

有研究认为miRNA-375在胃癌中表达下调，其可通过抑制PDK-1的表达促进肿瘤细胞的凋亡[5]，其在食管癌中研究尚不清楚，本研究通过实时荧光定量PCR验证差异miRNA-375在67对食管癌及对应正常组织的表达,旨在进一步了解miRNA在ESCC的发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

67例ESCC组织及相应的癌旁正常食管组织(距离肿块组织5 cm以上)来自于河南省林州市人民医院和林州市肿瘤医院(2004年-2009年)，所有患者术前均未接受任何放疗或化疗，术后有详细的随访记录。其中男性48例，女性19例；年龄≤60岁26例，>60岁41例；髓质型29例，溃疡型18例，缩窄型7例，蕈伞型13例。分期以国际抗癌联盟(international union against cancer，UICC)/美国肿瘤联合会(american joint committee on cancer，AJCC)TNM病理分期第六版为标准。所有组织收集后立即使用液氮冷冻后长期保存于-80 ℃冰箱。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

利用Trizol试剂(Invitrogen公司)裂解提取癌组织和癌旁正常组织RNA，严格按照说明书进行操作，并用紫外分光光度计滴定RNA浓度，保证所取RNA OD260/280在1.9～2.1之间，使用无酶水将RNA稀释至500～1 500 ng/μl。利用TIANGEN的miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂逆转录合成cDNA，参加反应的总RNA量为2 μg。

1.3 实时荧光定量PCR

使用ABI 7900HT荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR检测，选用凯基生物的SYBR Green I 作为荧光染料，选择miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒，采用12.5 μl的反应体系，扩增条件为热启动：95 ℃ 5 min；变性：95 ℃ 15 s；退火:56 ℃ 10 s；延伸：72 ℃ 10 s，共40个循环。根据各个孔荧光信号达到阈值的循环数作为Ct值，以U6为内参，用N=2-△△Ct值表示miRNA-375在食管癌组织及癌旁正常组织表达倍数差异。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 miRNA-375在食管癌组织中的表达

通过溶解曲线可见荧光定量PCR产物特异性好，未出现非特异性扩增，见图1；扩增曲线可见各样品均可扩增出目的产物，见图2。

2.2 miRNA-375在食管癌组织中表达的意义

通过采用循环阈值(ΔCt)对miRNA-375在食管癌和癌旁正常组织表达量进行定量分析，食管癌组织ΔCt为9.61±1.52，对应正常组织ΔCt为10.86±1.44，以N=2-ΔΔCt表示miRNA-375在食管癌组织表达量相对于癌旁正常组织的倍数， N<1表示肿瘤组织中miRNA-375表达水平低于癌旁正常组织，在检测的67例样本中，有54例表达水平下调，占总量的80.6%，只有19.4%表达上调，结果有统计学意义，见图3。

2.3 miRNA-374表达与其临床病理参数的关系

结果发现，miRNA-374的表达量与肿瘤TNM分期和是否有远处转移相关(P<0.05)，与患者年龄、性别及肿瘤病理类型无关，见表1。

图1 食管癌组织中miRNA-375的荧光定量PCR溶解曲线

图2 食管癌组织中miRNA-375的荧光定量PCR扩增曲线

图3 miRNA-375在食管鳞状细胞癌和癌旁组织中的表达量

3 讨论

本研究通过荧光定量PCR技术分析了ESCC组织与相应癌旁组织之间miRNA-375表达量的差异，并在此基础上探讨了miRNA-375的表达与ESCC临床病理的联系。

Mi-RNA最早发现于线虫等低等生物，调控线虫时序性发育，通过部分或完全的与靶向mRNA的3’非翻译区(3’UTR)结合，造成mRNA的翻译抑制或者切割降解，其互补配对的程度越多，造成的翻译抑制作用越大，完全互补则造成靶向mRNA的完全降解。同一机体在不同时期、不同部位需要不同的蛋白发挥作用，miRNA通过转录后调控使体内各种蛋白的表达按需要保持合适的比例，优化了机体对于细胞资源的利用[6]。近年来越来越多的研究显示，miRNA的异常表达与肿瘤发生存在相关性。有的可以抑制肿瘤细胞增殖、抑制血管生成；而另外一些miRNA则可以诱导癌基因的过度表达，促进肿瘤增殖和转移。Kumar等[7]的实验证实miRNA-98位于MYC的上游，可以抑制该基因的表达，从而诱导肿瘤细胞的凋亡，在肺癌和Burkitt淋巴瘤患者体内，miRNA-98表达下调，而使MYC癌基因过度激活，抑制肿瘤细胞的凋亡。有学者[8]通过转染过表达miR-126载体发现该miRNA可与VEGF-A mRNA的3’非翻译区(3’UTR)结合，造成VEGF-A表达沉默，抑制血管生成。目前对miRNA-375的研究还不多，Eliasson等[9]通过实验发现过表达miRNA-375可以抑制胰岛素的分泌，却不影响细胞内Ca2+信号通路。Tsukamoto Y发现miRNA-375在胃癌中表达下调，其可通过抑制PDK-1的表达促进肿瘤细胞的凋亡。

表1 miRNA表达与食管癌临床病理参数的相关性(例，%)

我们对67对ESCC组织及对应癌旁组织荧光定量PCR检测，发现miRNA-375在ESCC中呈低表达，明显低于癌旁正常组织，2组差异有统计学意义(P<0.0001)。通过miRNA-375的表达与临床病理资料的相关性研究表明，miRNA-375的表达与ESCC的TNM分期和远处转移相关，而与年龄、性别及组织类型等无明显相关，说明miRNA-375表达降低具有更大的转移能力和侵袭能力。因此我们认为，对miRNA-375的进一步了解有望帮助我们进一步了解食管鳞状细胞癌的发生、发展，通过对其表达的干预有望为诊断及治疗食管鳞状细胞癌提供新的途径。

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pecific microRNA regulates insulin secretion 〔J〕.Nature,2004,432(7014):226-230.

(编辑：吴小红)

Expression of miRNA-375 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma Tissues and Its Clinical Significance

LUHanjie，RENTiejun.

LuoyangCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Luoyang,471100

Objective To study the expression of miRNA-375 in esophageal squamous cell carcinoma tissues and its relationship with clinicopathologic characteristics.Methods Real-time quantitative polymerase chain reaction (Real-time PCR) was used to test the expression of miRNA-375 in 67 cases of esophagus cancer and precancerous tissues.Results Quantitative analysis of the expression of miRNA-375 in esophagus cancer and precancerous tissues was detected by ΔCt value,the ΔCt value of esophagus cancer and precancerous tissues were 9.61±1.52 and 10.86±1.44,respectively.Expression of miRNA-375 in 80.6% of esophagus cancer was lower than precancerous tissues(2-ΔΔCt<1).Conclusion The low expression of miRNA-375 might play an important role in the development and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma.

Esophageal squamous cell carcinoma;miRNA-375;Real-time PCR

471100 郑州大学附属洛阳中心医院

任铁军

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.10.006

R735.1

A

1001-5930(2016)10-1587-03

2015-11-24

2016-07-07)