塞来昔布通过Wnt/β-catenin信号通路对人结肠癌细胞SW480的影响

杨春勇 金若天 梁庆模

1.赤峰学院附属医院普外二科，内蒙古赤峰024000；2.南华大学附属南华医院普外科，湖南衡阳420002

塞来昔布通过Wnt/β-catenin信号通路对人结肠癌细胞SW480的影响

杨春勇1金若天1梁庆模2

1.赤峰学院附属医院普外二科，内蒙古赤峰024000；2.南华大学附属南华医院普外科，湖南衡阳420002

目的观察非甾体类抗炎药塞来昔布对体外培养的人结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响，并研究其与Wnt/β-catenin信号通路的关系，探讨塞来昔布抑制结肠肿瘤生长的分子机制。方法应用MTT法测定不同浓度塞来昔布（0、20、40、60、80、100 μmo1/L）对SW480细胞增殖的影响；应用流式细胞术分析不同浓度塞来昔布（0、20、40、80 μmo1/L）处理48 h后对SW480细胞凋亡的影响；应用Western b1ot法分析不同浓度塞来昔布（0、20、40、80 μmo1/L）处理48 h后SW480细胞中β-catenin蛋白和磷酸化的β-catenin蛋白的表达水平。结果MTT结果显示，塞来昔布对结肠癌细胞的增殖抑制有浓度依赖性和时间依赖性（P＜0.05）；流式细胞术分析显示，随着塞来昔布浓度的增加，结肠癌细胞的凋亡率明显增加（P＜0.05）；Western b1ot法检测结果显示，随着塞来昔布浓度的增加，β-catenin蛋白表达显著下降（P＜0.05），而磷酸化的β-catenin蛋白表达显著升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性。结论塞来昔布可以抑制结肠癌SW480细胞的Wnt/β-catenin信号通路，这可能是其抑制结肠癌细胞增殖、促进凋亡的重要机制。

塞来昔布；结肠癌；Wnt信号通路；β-catenin

随着人们饮食习惯的改变和生活环境的恶化，结肠癌的发病逐年增加，2014年全球估计新发病例数近137万例，居恶性肿瘤发病率的第3位［1］。大肠癌的发病机制复杂，其治疗包括手术、化疗、放疗及基因治疗在内的多种治疗方法。近年来非甾体类抗炎药（NSAIDs）的抗肿瘤作用日益受到人们的关注，其可以通过多种途径对肿瘤生长产生抑制作用［2-4］。而Wnt信号传导通路在结肠癌的发生发展中起着决定性的作用［5-8］，但NSAIDs塞来昔布对Wnt信号通路的作用机制尚不明确。本研究以人结肠癌SW480细胞为研究对象，观察塞来昔布对结肠癌SW480细胞增殖、凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响，探讨该作用与Wnt/β-catenin信号通路之间的关系，为其用于结肠的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要药品、试剂

人结肠癌细胞株SW480购自中南大学肿瘤研究所；塞来昔布（辉瑞制药公司，生产批号：M72189）；新生牛血清（杭州四季清公司）；RPMI1640（Gibco公司，USA）；胰蛋白酶（Amresco公司，USA）；BCA Protein Assay Reagent（PIERCE公司，USA）；兔抗人β-catenin多抗和磷酸化β-catenin多抗（Biowor1de Tecno1ogy Inc公司，USA）；DMSO和MTT（Sigma公司，USA）；PVDF膜（Mi11ipore公司，USA）；考马斯亮蓝、Western b1ot Lumino1 Reagent发光试剂和蛋白质分子量标准，Western b1ot凝胶试剂盒。

1.2 细胞培养

人结肠癌SW480细胞培养于体积分数为10%的新生牛血清和100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于环境为37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。取对数生长期的SW480细胞用于实验。

1.3 MTT比色法用于细胞生长抑制实验

取对数生长期的SW480细胞，将细胞以2×108/L的密度接种于100 mL培养瓶中，每瓶1 mL，再加完全培养基4 mL，培养24 h，同步化后，每瓶分别加入塞来昔布培养液，终浓度分别为0、20、40、60、80、100 μmo1/L，对照组为0 μmo1/L。每浓度设4个复孔，分别在加药后24、48、72 h后，避光下加入5 mg/mL MTT 20 μL，置培养箱内继续培养4 h，弃去培养液，加入二甲基亚砜（DMSO），10 min后酶标仪测490 nm处吸光度（A）值，计算细胞生长抑制率（IR）。IR的计算公式为：IR（%）=（对照组A值-实验组A值）/对照组A值×100%。实验重复3次。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

设对照组（塞来昔布为0 μmo1/L）和实验组（塞来昔布为20、40、80 μmo1/L）共4个组别，取对数生长期的SW480细胞用于实验。孵箱内细胞培育48 h后终止培养，胰酶消化后分别制成单细胞悬液。调整待测细胞密度为5×105个/mL后上机检测。实验重复3次。

1.5 Western blot检测细胞内β-catenin蛋白和磷酸化β-catenin蛋白

设对照组（塞来昔布为0 μmo1/L）和实验组（塞来昔布为20、40、80 μmo1/L）共4个组别。裂解各组细胞，并提取细胞内的蛋白，BCA测蛋白浓度并定量。制备SDSPAGE凝胶，每孔上样40 μg蛋白；取28 mA恒流进行电泳，电泳约30 min后待样品溴酚蓝行至分离胶、积层胶界面，再以120 V恒压、约1.5 h行分离胶电泳；将凝胶中蛋白电转移至PVDF膜上（预先用甲醇处理），温度为4℃，恒流105 mA，3 h；5%脱脂奶粉封闭室温下2 h；4℃孵育一抗，TBST液洗膜3次，每次约5 min；室温下二抗（1∶5000）孵育1 h，TBST液洗膜3次，每次约5 min；于暗室中加入Western b1ot发光试剂约1 min，X片曝光、显影、定影，胶片扫描后采用A1pha ImagerTM2200软件测定印迹区带的灰度面积值。实验重复3遍。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计分析软件进行统计分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度塞来昔布对SW480细胞增殖的影响

MTT法显示，不同浓度塞来昔布处理SW480细胞24、48、72 h后，抑制率随药物浓度增加而增高（P＜0.05），随作用时间的延长而增高（P＜0.05），见表1、图1。表明塞来昔布能抑制SW480细胞的增殖，且呈时间依赖性和剂量依赖性。

表1 塞来昔布对SW480细胞增殖的影响（%，）

表1 塞来昔布对SW480细胞增殖的影响（%，）

塞来昔布（μmo1/L）抑制率24 h48 h72 h F值P值0 0 0 0 20 40 60 80 100 F值P值2.37±0.35 6.95±0.24 10.93±0.94 15.40±0.86 22.90±1.31 573.66 0.000 5.95±0.37 10.93±0.56 15.40±0.18 23.25±0.59 27.28±0.71 1904.89 0.000 7.32±0.39 13.13±0.45 22.27±0.98 26.20±0.26 35.83±0.78 2089.11 0.000 191.87 204.42 279.16 323.28 234.18 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

图1 不同浓度和不同时间段塞来昔布对SW480细胞增殖的影响

2.2不同浓度塞来昔布对SW480细胞凋亡的影响

流式细胞仪分析结果显示，不同浓度的塞来昔布处理SW480细胞48 h后细胞出现了明显的凋亡，且不同浓度塞来昔布处理组之间的凋亡率差异有统计学意义（F=7839.49，P=0.000），见图2～3。表明随着塞来昔布浓度的增加SW480细胞凋亡率增加。

图2 不同浓度塞来昔布对SW480细胞凋亡的影响

图3 不同浓度塞来昔布对SW480细胞凋亡率的比较

2.3 不同浓度塞来昔布对SW480细胞中β-catenin蛋白和磷酸化的β-catenin蛋白表达的影响

Western b1ot法检测表明，不同浓度塞来昔布处理SW480细胞48 h后，β-catenin蛋白的表达随塞来昔布浓度的增加逐渐减少，且不同浓度塞来昔布处理组之间的差异有统计学意义（F=206.48，P=0.000），而磷酸化的β-catenin蛋白的表达随塞来昔布浓度的增加逐渐增加，且不同浓度塞来昔布处理组之间的差异有统计学意义（F=199.96，P=0.000），见图4～5。表明塞来昔布可以促进结肠癌细胞β-catenin蛋白的磷酸化而降解，从而减少β-catenin蛋白的表达。

图4 不同浓度塞来昔布对SW480细胞中β-catenin蛋白和磷酸化的β-catenin蛋白表达的影响

图5 不同浓度塞来昔布组间β-Catenin和磷酸化β-Catenin蛋白相对表达量的比较

3 讨论

结肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，占胃肠道肿瘤的第3位［9］，近年来，结肠癌的发病率与病死率在我国呈上升的趋势，高发年龄普遍在50～60岁［10］。其治疗主要是以手术为主的综合治疗，包括术后化疗、放疗、靶向治疗及中医治疗［11］。而临床上常用的化疗药物多为细胞毒性药物，其副作用较大，尤其对晚期肿瘤患者，耐受性较差，往往不能应用其化疗，因此，选择高效低毒的非细胞毒性的药物成为肿瘤治疗的热点。

最近研究表明环氧化酶2（COX-2）在胃癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌和头颈部肿瘤等中普遍存在过度表达现象，其表达量为基础表达量的20～80倍［12］。近年来NSAIDs的抗肿瘤作用日益受到人们的关注，NSAIDs能够通过多种途径抑制肿瘤细胞；而高选择性COX-2抑制剂，如美罗西康、罗非昔布、塞来昔布等成为了研究的焦点，1999年美国FDA批准塞来昔布作为预防大肠腺瘤的药物［13-14］。本课题选择塞来昔布作为研究药物，实验表明随着塞来昔布浓度的增加，其能够抑制结肠癌SW480细胞的增殖，促进凋亡。

Wnt/β-catenin信号传导通路的异常激活与人类许多肿瘤的发生发展密切相关［5-8］，其与结肠癌的发生发展也密切相关，而塞来昔布对结肠癌Wnt/βcatenin信号传导通路的影响尚未有研究。

Wnt/β-catenin信号传导通路的异常激活的发生机制如下：①在没有Wnt信号刺激时，胞浆内β-catenin蛋白与Axin、APC、GSK3和CK1形成“降解复合体”，并被磷酸化，形成磷酸化的β-catenin蛋白，进而被泛素联接酶β-TrCP识别并被降解，从而不能激活其靶基因［15-20］。②在有Wnt信号刺激时，Wnt配体与其受体LRP5/6和Frizz1ed结合，使得Dv1与Axin结合，从而阻碍“降解复合体”形成，进而β-catenin蛋白在胞浆内累积并进入细胞核，与TCF/LEF结合激活其下游的靶基因，如c-myc和Cyc1in D等［21-23］。本研究表明，随着塞来昔布浓度的增加，塞来昔布能够增加磷酸化β-catenin蛋白的表达（P＜0.05），而减少β-catenin蛋白的表达（P＜0.05），提示塞来昔布能够通过促进β-catenin蛋白的磷酸化，减少胞浆内β-catenin蛋白的表达，进而抑制Wnt/β-catenin信号传导通路。

综上所述，塞来昔布可抑制结肠癌SW480细胞的Wnt/β-catenin信号通路，这可能是其抑制结肠癌细胞的增殖、促进其凋亡的重要机制，这可为临床上塞来昔布治疗结肠癌提供理论基础。

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Effects of Celecoxib on the human colon cancer SW480 cells through Wnt/β-catenin Pathway

YANG Chunyong1JIN Ruotian1LIANG Qingmo2
1.The Second Department of Genera1 Surgery，Affi1iated Hospita1 of Chifeng Co11ege，Inner Mongo1ia Autonomous Region，Chifeng024000，China；2.Department of Genera1 Surgery，Affi1iated Nanhua Hospita1，University of South China，Hu'nan Province，Hengyang420002，China

Objective To exp1ore the effects of nonsteroida1 anti-inf1ammatory drugs Ce1ecoxib on the pro1iferation and apoptosis of human co1on cancer SW480 ce11s cu1tured in vitro，and to research the corre1ation between the effects and Wnt/β-catenin pathway，to approach the mo1ecu1ar mechanisms of Ce1ecoxib in inhibiting co1on tumor.Methods MTT assay was used to test the effect of different concentrations of Ce1ecoxib（0，20，40，60，80，100 μmo1/L）on the pro1iferation of SW480 ce11s；the f1ow cytometry was used to ana1yze the effects of different concentrations of Ce1ecoxib（0，20，40，80 μmo1/L）after administration for 48 h on the apoptosis of SW480 ce11s；the Western b1ot was used to examine the expression of β-catenin protein and phosphory1ated β-catenin protein which were treated with different concentrations of Ce1ecoxib（0，20，40，80 μmo1/L）after administration for 48 h.Results MTT assay showed that Ce1ecoxib cou1d inhibit the pro1iferation of SW480 ce11s in a dose and time dependent manner（P＜0.05）；the f1ow cytometry ana1ysis showed that the ce11 apoptosis rate was significant1y increased with the increase of concentrations of Ce1ecoxib（P＜0.05）；the Western b1ot showed that the expression of β-catenin protein was significant1y down-regu1ated（P＜0.05）and the expression of phosphory1ated β-catenin protein was significant1y up-regu1ated（P＜0.05）with the increase of concentrations of Ce1ecoxib，in a dose dependent manner.Conclusion Ce1ecoxib can inhibit Wnt/β-catenin pathway of human co1on cancer SW480 ce11s，and this may be the important mechanism of Ce1ecoxib in inhibiting the pro1iferation of co1on cancer ce11s and promoting apoptosis.

Ce1ecoxib；Co1on cancer；Wnt pathway；β-catenin

R735.3

A

1673-7210（2016）07（c）-0054-04

2016-03-06本文编辑：张瑜杰）

梁庆模（1956-），男，硕士研究生，教授，硕士生导师；研究方向：结直肠癌的治疗。