柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶真核表达质粒的构建及其在DF-1细胞中的表达

朱雪龙，黄　兵,3，韩红玉，赵其平，朱顺海，李　聪，门启斐,2，王自文，夏伟丽,2，董　辉

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241；2. 上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234；3. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）

柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶真核表达质粒的构建及其在DF-1细胞中的表达

朱雪龙1，黄兵1,3，韩红玉1，赵其平1，朱顺海1，李聪1，门启斐1,2，王自文1，夏伟丽1,2，董辉1

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241；2. 上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234；3. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）

为了构建柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Eimeria tenella serine/threonine protein kinase，EtSTK）基因的真核表达重组质粒，并实现在DF-1细胞中的表达，以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板，PCR扩增EtSTK基因，将扩展产物与真核表达质粒pcDNA3.1-flag连接，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-flag-EtSTK，测序鉴定正确后，转染DF-1细胞进行表达，利用Western blot和间接免疫荧光（indirect immunofl uorescene assay，IFA）对其表达情况进行鉴定。结果表明重组质粒pcDNA3.1-flag-EtSTK构建成功。Western blot显示在54 kDa处出现条带；IFA检测到特异性的绿色荧光，表明构建的重组质粒pcDNA3.1-fl ag-EtSTK成功地在DF-1中实现了表达。本研究结果为深入了解柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的功能及球虫核酸疫苗提供了基础。

柔嫩艾美耳球虫；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；DF-1细胞；真核表达

鸡球虫病是一种全球性的原虫病，在集约化养殖场中的发病率高达50%～70%，死亡率为20%～30%，严重时甚至可达80%，每年给全球养禽业造成的直接经济损失高达5亿英镑[1]。在公认的7种鸡球虫中，柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）分布最广，致病力最强[2]。目前，鸡球虫病的控制主要依赖抗球虫药物，但球虫耐药性的产生已严重影响了药物防治的效果，至今，人们已从养鸡场中分离出几乎对所有使用过的抗球虫药有耐药性的虫株。相对于抗球虫药来说，球虫疫苗是防治球虫病更为理想的选择，与传统疫苗相比，核酸疫苗具有很多优势，是当前球虫疫苗研究的热点[3]，因此，寻找新核酸疫苗候选分子意义重大。

柔嫩艾美耳球虫隶属于顶复器门，需要入侵宿主细胞并在其中发育繁殖以完成整个生活史。顶复器门原虫均拥有由微线体（Microneme）、棒状体（Rhoptry）和致密颗粒（Dense granules）等细胞器组成的顶复合体，这些细胞器所分泌的蛋白在虫体入侵宿主细胞过程中扮演着重要的角色[4]。研究表明，在顶复器门原虫入侵宿主细胞过程中，虫体与细胞接触时会形成运动连接环（moving junction，MJ），该结构对虫体成功入侵宿主细胞具有重要作用[5]。顶体膜抗原1（apical membrance antigen-1，AMA1）是一种由顶复器门原虫微线体分泌的蛋白，能与棒状体分泌的数个蛋白形成复合体，是运动连接环的主要成分[6]。为了研究EtAMA1及其相互作用分子在虫体入侵过程中的具体作用，本实验室前期研究中利用酵母双杂交技术（Yeast two hybrid），以EtAMA1为诱饵蛋白筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA文库，获得了一些与EtAMA1相互作用的潜在蛋白EST序列[7]，其中编号为56-2的EST序列与本实验室前期发现的柔嫩艾美耳球虫子孢子与未孢子化卵囊的差异表达基因ZB1-A08序列完全一致[8]。本研究对该序列进行了生物信息学分析，发现其具有一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，STK）结构域，构建其全长编码框序列的真核表达质粒，并实现了在DF-1细胞中的表达，为进一步研究STK功能奠定了基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1虫株柔嫩艾美耳球虫上海株由中国农业科学院上海兽医研究所动物原虫病创新团队保存提供。

1.1.2载体、菌株与细胞pGEM-T-easy vector购自美国Promega公司；大肠杆菌TOP10购自上海天根生物技术有限公司；DF-1细胞由中国农业科学院上海兽医研究所丁铲研究员馈赠；真核表达载体pcDNA3.1-flag vector由本实验室保存提供。

1.1.3主要试剂与试剂盒Ex Taq、限制性内切酶BamH I和EcoR I、Trizol购自大连TaKaRa公司；DNA Marker（DL2000）、DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、2 x Taq PCR MasterMix购自上海天根生物技术有限公司；T4 DNA连接酶购自美国Promega公司；opti-MEM、DMEM、胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司；Western及IP细胞裂解液、DAPI购自上海碧云天生物技术有限公司；FITC标记山羊抗兔IgG购自Jackson Immuno Research公司；PageRulerTMPrestained protein ladder购自美国Themo scientific公司；LipofectamineTM2000、M-MLV Reverse Transcriptase购自美国Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA提取以保存的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊接种2周龄无球虫鸡，收集感染后d7盲肠中的卵囊，孢子化后，参照索勋[9]、黄兵等[10]报道方法对卵囊进行纯化，并按宋翠萍等[11]报道方法提取子孢子。按照Trizol说明书步骤提取子孢子总RNA，并用核酸凝胶电泳及紫外分光光度计检测所提总RNA的浓度和纯度，符合要求后保存备用。

1.2.2引物设计与合成根据柔嫩艾美耳球虫子孢子与未孢子化卵囊的差异表达基因ZB1-A08基因序列（登录号：EF552217.1）设计引物，扩增该基因完整ORF序列，长度为1524 bp。其中，上游引物序列为：5′-CGGGATCCATGGCCGCTTCATTCAGTTC TCTTG-3′，下游引物序列为：5′-CGGAATTCTCA CGAATAGATCAGGACGCTATGC-3′，上下游引物中分别引入BamH I和EcoR I限制性内切酶酶切位点（下划线处），引物由上海赛百盛生物技术有限公司合成。

1.2.3PCR扩增与测序将1.2.1中所制备的子孢子总RNA按M-MLV Reverse Transcriptase说明书提供的步骤反转录为cDNA，并以其作为模板进行PCR扩增，反应体系为：cDNA 2μL，上、下游引物各 1μL ，ddH2O 5μL，2 x Taq PCR MasterMix 10 μL，Ex Taq 1μL，总体积共20μL。反应参数：95℃预变性3 min；95℃变化 45 s，58.5℃退火 45 s，72℃延伸 2 min，35个循环；72℃延伸10 min。回收特异性PCR产物，与pGEM-T-easy vector连接，连接产物转化入TOP10大肠杆菌感受态细胞，涂在含Amp+平板上进行蓝白斑筛选。挑取白斑菌落过夜培养后，以其为模板进行PCR鉴定，经鉴定分子量大小与预期一致的阳性菌落送上海桑尼生物技术有限公司测序。

1.2.4生物信息学分析利用在线工具ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析所获得的序列，找出其开放阅读框；利用ProtParam工具（http://cn.expasy.org/tools/protparam.html）分析编码蛋白质理论分子量大小、等电点、氨基酸组成等；利用TMHMM服务器（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM-2.0/）分析该编码蛋白有无跨膜结构；利用SignalP3.0在线分析软件（www.cbs.dtu. dk/services/SignalP）分析编码蛋白有无信号肽；使用motif_scan工具（http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/ motif_scan）寻找氨基酸序列的结构域，推测目的蛋白可能具备的功能；利用北京大学生物信息中心WebLab提供的Antigenic程序（http://weblab.cbi.pku. edu.cn/program.inputForm.do?program=antigenic）分析其抗原位点；利用CDD程序（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/structure/cdd/cdd.shtml）对氨基酸序列进行功能保守功能域分析，判断该蛋白是否具有完整的保守结构域。

1.2.5重组真核表达质粒的构建按质粒试剂盒说明书提供的步骤提取1.2.3中构建的重组质粒，用限制性内切酶BamH I和EcoR I分别对pcDNA3.1-flag空载体以及重组质粒进行双酶切。酶切产物分别经1%琼脂糖凝胶电泳后，用琼脂糖凝胶电泳DNA回收试剂盒回收目的片段，4℃连接过夜，连接产物转入TOP10大肠杆菌感受态细胞中，涂板，37℃培养8 h，挑取单克隆菌落于4 mL LB液体培养基中培养12 h，进行PCR鉴定。对鉴定为阳性的菌液，用质粒小提试剂盒提取重组质粒，以BamH I和EcoR I限制性内切酶进行双酶切鉴定，阳性克隆送上海桑尼生物技术有限公司测序。

1.2.6DF-1细胞的复苏与培养将冻存的DF-1细胞从液氮中取出，立即放入37℃温水浴中，融化后将其转入无菌EP管中，1500 r/min离心5 min，弃上清以除去冻存液中的DMSO等成份，用含10%FBS、1%双抗的DMEM培养液悬浮细胞，转入细胞培养瓶内，置于37℃、5% CO2浓度的细胞培养箱中培养，每天用倒置显微镜对细胞状态进行观察，每2～3 d更换1次培养液，待细胞长满培养瓶壁后及时分瓶，传2～3代至细胞状态良好后进行后续实验。

1.2.7真核表达重组质粒转染DF-1细胞将装有DF-1细胞的细胞培养瓶移至超净台内，弃去其中的培养液，用opti-MEM洗涤瓶中贴壁的DF-1细胞以除去残留的FBS，加入0.25%的trypsin-EDTA ，37℃消化2 min。弃去trypsin-EDTA，加入适量DMEM培养液重悬细胞，细胞计数后以6×105个细胞/孔铺被六孔板2块，置于37℃、5% CO2浓度的细胞培养箱中培养过夜。次日按照LipofectamineTM2000脂质体转染步骤分别将pcDNA3.1-flag空质粒和真核重组质粒转染入DF-1细胞，37℃、5% CO2条件下培养6 h后，更换为含2%FBS、1%双抗的DMEM培养液培养，培养条件不变。48 h后将1块六孔板中的DF-1细胞用于间接免疫荧光检测（indirect immunofluorescene assay，IFA），收集另1块六孔板中的DF-1细胞，使用Western及IP细胞裂解液提取DF-1细胞蛋白后用于Western blot检测。

1.2.8Western blot鉴定向1.2.7中所制备的1块六孔板中每孔加入适量的Western及IP细胞裂解液裂解DF-1细胞，具体操作根据说明书进行，4℃、12 000×g 离心5 min，取上清进行SDS-PAGE。半干法电转至PVDF膜上，5%脱脂乳4℃封闭过夜；PBS洗涤5次，加入1:50稀释的抗ZB1-A08蛋白兔血清，37℃孵育3 h；PBST洗涤5次，加入1:8000稀释的近红外荧光山羊抗兔IgG二抗，37℃避光孵育2 h；PBS洗涤5次后使用Odyssey双色红外激光成像系统拍照，保存。

1.2.9间接免疫荧光（indirect immunofluorescene assay，IFA）检测将1.2.7中所制备的另1块六孔板取出，吸净培养基，每孔用1 mL PBS轻柔洗涤3次，加入2 mL 2%多聚甲醛，室温固定15 min；用1 mL PBS洗涤5次，加入2 mL 1%Triton X-100，室温处理15 min；用1 mL PBS洗涤5次，加入2 mL 5%BSA，4℃封闭过夜；PBS洗涤5次，加入1:50稀释的抗ZB1-A08蛋白兔血清，37℃孵育2 h；PBS洗涤5次，加入1:400稀释的FITC标记山羊抗兔IgG二抗，避光孵育2 h；PBS洗涤5次，加入1:10 000稀释的DAPI染核，避光孵育15 min；PBS洗涤5次，用镊子轻轻取出飞片，倒盖于滴有抗荧光淬灭剂的载玻片上，置于正置荧光显微镜下观察，拍照。

2　结果

2.1基因的克隆以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板，用设计的特异性引物进行PCR，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，发现在1500 bp左右有1条特异性的单一条带，大小为1524 bp，与预期一致（图1）。

图1　EtSTK基因的PCR扩增Fig. 1　PCR amplifi cation of EtSTK gene

2.2基因序列的生物信息学分析对构建的重组克隆质粒进行测序，并对所获得的序列进行生物信息学分析，结果发现该基因的核苷酸序列与柔嫩艾美耳球虫子孢子与未孢子化卵囊的差异表达基因ZB1-A08基因100%同源，保守结构域分析发现其具有一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，STK）结构域（图2），故将其命名为柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Eimeria tenella serine/threonine protein kinase，EtSTK）。其ORF大小为1524 bp，编码507个氨基酸，理论分子量为54 kDa，预测等电点为8.36。该基因编码蛋白的1～56位氨基酸位于细胞内部，80～507氨基酸位于细胞膜外，在57～79位氨基酸间形成一个典型的跨膜旋转区；无信号肽；可能有24个抗原位点；不具有卷曲螺旋结构；可能含有1个N端糖基化位点，1个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点，7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，1个N-myristoylation位点以及7个蛋白激酶C磷酸化位点。

图2　EtSTK蛋白的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域Fig. 2　Serine / threonine protein kinase domain of the EtSTK protein

2.3真核表达重组质粒的构建使用限制性内切酶BamH I和EcoR I分别对pcDNA3.1-flag空载体以及鉴定正确的重组克隆质粒进行双酶切，切胶纯化，胶回收后连接，转化入TOP10大肠杆菌感受态细胞，涂板挑菌、摇菌，抽提质粒，构建了真核表达重组质粒，命名为pcDNA3.1-flag-EtSTK，双酶切产物电泳后出现2个条带（图3）。序列测定显示目的片段正确插入到质粒当中，无移码和突变现象。

2.4Western blot鉴定结果显示，转染pcDNA3.1-flag-EtSTK重组真核表达质粒的DF-1细胞在约54 kDa处有一条特异性的条带，而转染了pcDNA 3.1-flag空质粒的DF-1细胞未检测到相应条带（图4）。

图3　重组质粒pcDNA3.1-fl ag-EtSTK双酶切鉴定结果Fig. 3　Identifi cation of the recombinant plasmid pcDNA3.1-fl ag-EtSTK by restriction enzymes digestion

图4　重组质粒pcDNA3.1-fl ag-EtSTK 转染DF-1细胞的Western blot鉴定Fig. 4　Western blot identifi cation of DF-1 cells transfected with recombinant plasmid pcDNA3.1-fl ag-EtSTK

2.5间接免疫荧光检测结果显示，转染了pcDNA 3.1-flag-EtSTK重组真核表达质粒的DF-1细胞在绿色荧光通道中可以看到清晰、特异的绿色荧光（图5A），DAPI染核后可以看到清晰、特异的有蓝色荧光附着的细胞核（染核图略）；而转染了pcDNA3.1-flag空质粒的DF-1细胞无绿色荧光（图5B、图5C），DAPI染核后也可看到清晰、特异的有蓝色荧光附着的细胞核（染核图略）。

图5　重组质粒pcDNA3.1-fl ag-EtSTK 转染DF-1细胞的间接免疫荧光检测Fig. 5　IFA result of recombinant plasmid pcDNA 3.1-fl ag-EtSTK in DF-1 cells

3　讨论

蛋白磷酸化是生物体调节细胞对各种外界信号应答的重要调节机制。蛋白激酶通过对底物蛋白的磷酸化修饰参与细胞信号转导，是细胞信号转导过程中起重要作用的信号分子[12]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，STK）是一类能使特定底物蛋白中丝氨酸或苏氨酸羟基磷酸化的蛋白激酶，通过催化多种功能蛋白（如酶、受体、运输蛋白、调节蛋白、核内蛋白等）的磷酸化，STK可以改变功能蛋白的构象，导致功能蛋白活性、性质的变化，从而调节细胞多种生命活动过程。目前已在日本血吸虫（Schistosoma japonicum）[13]、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）[14]、恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）[15]等寄生虫中发现有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它在细胞信号转导过程中发挥重要功能，但至今该酶在球虫中的作用尚不清楚。本文对实验室前期研究中发现的可能与EtAMA1作用的一种蛋白的基因进行了克隆，序列分析发现该基因是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其功能可能与蛋白磷酸化相关。由于该基因是潜在的EtAMA1作用蛋白，而AMA1在球虫入侵宿主细胞中发挥重要功能[16]，因此推测该蛋白可能也参与了子孢子入侵宿主细胞的过程，但仍需进一步研究证实。

用于蛋白表达的系统包括原核表达系统和真核表达系统，与前者相比，后者表达出的蛋白更接近于天然蛋白，有利于对天然蛋白功能进一步的研究。常用于真核表达的载体有pEGFP[17]、pWPXLd[18]、pcDNA3.1（+）[19]等，其中以pcDNA3.1（+）最为常见。pcDNA3.1（+）全长5427 bp，带有CMV、BGH、SV40等启动子，其中CMV启动子含有一段非常强力的增强子序列，表达外源基因时几乎没有细胞特异性，能在绝大多数哺乳动物细胞中稳定高效表达[20]。此外，pcDNA3.1（+）还带有一个Neo抗性基因便于转染细胞的筛选，常用于融合表达外源基因蛋白和核酸疫苗的研究[21]。本研究中使用的pcDNA3.1-flag质粒由pcDNA3.1（+）质粒改造而成，主要是在该载体多克隆位点的N端添加一个flag标签，flag标签序列简短，对目的蛋白的影响小，易加在目的蛋白的N端或C端并与之构成融合蛋白，可用Anti-flag单克隆抗体对其检测[22]。此外，flag标签还可用于免疫亲和层析，在非变性条件下洗脱flag标签融合蛋白[23]。pcDNA3.1质粒具有表达重组蛋白高效稳定，易于纯化等优点，被广泛应用于病毒、细菌、寄生虫相关研究中，如羊痘病毒P32基因真核表达质粒的构建[24]、嗜肺军团菌免疫原蛋白免疫保护力相关研究[25]、弓形虫主要表面抗原P30复合基因疫苗的构建[26]等。pcDNA3.1载体也被广泛应用于球虫基因的真核表达以及DNA疫苗的研制中，例如卢军霞[27]将堆型艾美耳球虫第二代裂殖子表面抗原3-1E与pcDNA3.1质粒连接，构建了pcDNA3.1-3-1E真核表达质粒。张丽娟[28]对其构建的真核表达质粒进行研究，发现pcDNA3.1-3-1E真核表达质粒能有效提高雏鸡的细胞免疫和体液免疫水平，且安全无害。翟颀[29]构建了柔嫩艾美耳球虫保守蛋白EtCHP559基因的真核重组表达质粒pcDNA3.1-flag-EtCHP559，发现所获重组蛋白的多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞有明显的抑制作用。

对于真核重组质粒蛋白表达细胞的选择，常用的有293T[30]、HeLa[31]、BHK[32]、DF-1[33]等。DF-1是一种已商品化的稳定的传代细胞，来源于East lansing line（ELL-0）鸡胚成纤维细胞，被广泛应用于病毒疫苗生产、重组病毒或蛋白的表达。姜连连等[34]首次以DF-1作为柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞，建立了球虫DF-1细胞培养体系。本研究对象柔嫩艾美耳球虫寄生于鸡盲肠细胞内，相比其他细胞，DF-1细胞更贴近柔嫩艾美耳球虫的天然宿主细胞。Western blot和IFA均证实，本研究构建的pcDNA3.1-flag-EtSTK真核表达质粒在DF-1细胞中成功得到表达，这为进一步研究柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的特性，研制球虫核酸疫苗提供了基础。

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CONSTRUCTION OF EUKARYOTIC EXPRESSION PLASMIDS OF EIMERIA TENELLA SERINE / THREONINE PROTEIN KINASE AND ITS EXPRESSION IN DF-1 CELLS

ZHU Xue-long1, HUANG Bing1,3, HAN Hong-yu1, ZHAO Qi-ping1, ZHU Shun-hai1, LI Cong1, MEN Qi-fei1,2, WANG Zi-wen1, XIA Wei-li1,2, DONG Hui1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

In order to construct eukaryotic recombinant expression plasmids of Eimeria tenella serine/threonine protein kinase（EtSTK）gene and express it in DF-1 cells, the EtSTK gene was amplifi ed by PCR with the cDNAs of the sporozoite of E. tenella as template. The PCR products were subcloned to pcDNA3.1-fl ag vector. The recombinant plasmids were transfected into DF-1 cells. The expression of recombinant EtSTK protein in DF-1 cells was detected with Western blot and indirect immunofl uorescene assay（IFA）. A protein about 54 kDa which was in accordance with molecular weight of target protein was recognized by recombinant EtSTK antiserum in Western blot. Green fl uorescence was observed by IFA in DF-1 cells. These results indicated that the recombinant plasmids of pcDNA3.1-fl ag-EtSTK were successfully constructed and expressed in DF-1 cells, which laid a foundation for future research on biological functions of EtSTK and Eimeria DNA vaccine.

Eimeria tenella; serine/threonine protein kinase; DF-1 cell; eukaryotic expression

S852.723

A

1674-6422（2016）03-0048-07

2016-02-29

国家自然科学基金（31272557）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2015JB10）

朱雪龙，男，硕士研究生，预防兽医学专业

董辉，E-mail：donghui@shvri.ac.cn