大、小鼠来源32 d日本血吸虫凋亡相关基因表达分析

王　涛，洪　炀，傅志强，曹晓丹，吕　超，窦雪峰，许　瑞，韩　倩，贾秉光，赵枝新，林矫矫

（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241）

大、小鼠来源32 d日本血吸虫凋亡相关基因表达分析

王涛，洪炀，傅志强，曹晓丹，吕超，窦雪峰，许瑞，韩倩，贾秉光，赵枝新，林矫矫

（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241）

大鼠为日本血吸虫的非适宜宿主，而小鼠为日本血吸虫的适宜宿主。前期研究表明细胞凋亡影响了日本血吸虫在不同适宜性宿主体内的生长发育，然而血吸虫中存在哪些凋亡相关基因及凋亡通路? 哪些凋亡相关基因可能影响血吸虫的生长发育？相关文献报道较少。本研究构建了日本血吸虫全基因组本地BLAST数据库，利用人的凋亡基因为索引搜索到了15个日本血吸虫凋亡相关基因。 同时收集了大、小鼠来源32 d日本血吸虫，利用荧光定量PCR分析了32 d虫体中凋亡相关基因的表达情况，鉴定了大鼠和小鼠两种不同适宜性宿主来源32 d日本血吸虫差异表达的凋亡相关分子，为探讨日本血吸虫与不同适宜性宿主的相互作用机制提供了基础。

细胞凋亡；凋亡基因；本地BLAST

日本血吸虫病（Schistosomiasis）是我国动物疫病防控长期规划中优先防控的重要疾病之一[1]。日本血吸虫具有逃避宿主免疫攻击的机制，可在免疫系统正常的宿主体内正常生存[2]。日本血吸虫的生活史比较复杂，这也增加了血吸虫病防治的难度。

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种方式，在机体清除受损或无用的细胞中发挥重要作用。近几年，细胞凋亡在癌症治疗方面被给予了高度关注[3]。与正常细胞相比，凋亡基因在癌细胞中的表达水平存在显著的差异，因此利用细胞自身带有的“自杀”机制，即凋亡机制来治疗癌症具有相当诱人的前景。从某种程度上说寄生虫病也是一种“癌症”[4]，因此对日本血吸虫细胞凋亡的研究具有重要意义。

在中国，日本血吸虫可自然感染包括人在内的40余种哺乳动物[5]。早期流行病学调查时发现不同宿主对日本血吸虫的感染具有不同的敏感性，如与大鼠相比，小鼠具有更高的易感性。尽管有研究表明细胞凋亡影响了日本血吸虫在不同宿主体内的生长发育[6]，然而对哪些凋亡相关基因和通路影响血吸虫的生长发育仍鲜有报道。本研究利用日本血吸虫非适宜性宿主Wistar大鼠和适宜宿主BALB/c小鼠为动物模型，收集了大、小鼠来源的32 d日本血吸虫虫体，利用RT-PCR技术分析不同宿主来源日本血吸虫凋亡相关基因的表达情况，为进一步阐明日本血吸虫与不同适宜性宿主的相互作用机制及日本血吸虫新药物靶点的筛选提供了基础。

1　材料和方法

1.1材料Wistar大鼠（5周龄、雄性）和BALB/c小鼠（5周龄、雄性）均购自上海斯莱克实验动物有限公司；中国大陆株日本血吸虫阳性钉螺由中国农业科学院上海兽医研究所钉螺室提供；Trizol 购自Invitrogen公司; DEPC水、One-Step PrimeScript RTPCR Kit 和 SYBR®Premix EX TaqTMkit（Perfect Real-Time）均购自TaKaRa公司。

1.2日本血吸虫全基因组本地BLAST数据库建立首先从NCBI网站下载最新版本的本地BLAST程序包（Version BLAST-2.2.29+），然后从GeneDB下载日本血吸虫全基因组数据库（SchistoDB v3.0, http:// SchistoDB.net），最后按照本地BLAST数据库建立方法建立日本血吸虫全基因组本地BLAST数据库。

1.3日本血吸虫凋亡相关基因的搜索利用建好的日本血吸虫全基因组本地BLAST数据库，人的凋亡基因（表1）为Query sequence搜索日本血吸虫的凋亡相关基因。

表1　人的凋亡基因Table 1　Human apoptosis genes

1.4大、小鼠来源32 d日本血吸虫的收集将5只Wistar 大鼠和5只BALB/c小鼠采用腹部贴片法人工感染日本血吸虫尾蚴。每只大鼠感染600条尾蚴，每只小鼠感染100条尾蚴。感染后32 d剖杀，利用37℃预热的柠檬生理盐水通过静脉灌注法收集虫体，用PBS缓冲液充分洗涤后液氮保存备用。

1.532 d日本血吸虫cDNA模板的制备取液氮保存的大、小鼠来源32 d虫体，转移至无RNA酶的EP管中，每管约150 mg。 加入1 mL Trizol并按照说明书提取各组日本血吸虫虫体总RNA。利用DNA酶去除基因组DNA后，用PrimeScript®RT reagent Kit反转录试剂盒将各组虫体RNA反转录成cDNA，保存备用。

1.6荧光定量PCR检测凋亡相关基因的表达量以1.5制备的大、小鼠来源14 d和32 d虫体cDNA为模板，以日本血吸虫SjNADH为内参基因，利用SYBR ® Premix EX TaqTM（Perfect Real-Time）kit 试剂盒检测大、小鼠来源32 d虫体凋亡相关基因的表达水平，并进行比较分析。日本血吸虫凋亡相关基因的荧光定量PCR引物如表2所示。数据用2-ΔΔCT计算处理，用x±s表示，利用one-way ANOVA进行统计学分析。实验进行3次独立重复。

2　结果

2.1日本血吸虫基因组本地BLAST数据库建立按照NCBI本地BLAST数据库手册，成功建立了日本血吸虫全基因组本地BLAST数据库（结果未显示）。

2.2日本血吸虫凋亡相关基因的搜索以人的凋亡基因氨基酸序列为Query sequence，利用建好的日本血吸虫基因组本地BLAST数据库搜索日本血吸虫的凋亡相关基因。结果共在日本血吸虫基因组中找到15个与日本血吸虫凋亡相关的基因，结果见表3。

2.3大、小鼠来源132 d日本血吸虫凋亡相关基因的表达分析通过RT-PCR分析日本血吸虫15个凋亡相关基因，结果显示大、小鼠来源32 d虫体中凋亡相关基因中，有4个基因（API、BAX、BIRP和CYC）在32 d大、小鼠来源虫体中的表达差异无显著性统计学意义；有11个基因（CASP7、IAP、BCL-2、TNFR、AIF、ATM、CASP3、CASP9、APAF、BAK和CIAP）在大、小鼠来源的虫体中的表达差异具有显著性统计学意义，其中有10个基因（BCL-2、TNFR、AIF、ATM、API、CASP3、CASP9、APAF、BAK和CIAP）在大鼠来源虫体中高表达，仅1个基因（CASP7）在小鼠来源虫体中高表达（图1）。

3　讨论

日本血吸虫全基因组数据在2009年完成并发表在Nature杂志上[7]，这为日本血吸虫细胞凋亡的研究提供了许多有利资源。尽管细胞凋亡在人等模式生物中的研究已经比较透彻，但是关于日本血吸虫凋亡基因及凋亡机制的研究仍处于起步阶段。因此，可以借鉴人的凋亡基因相关信息进行比对，寻找日本血吸虫相应的凋亡相关基因。通过建立日本血吸虫本地BLAST数据库和相似性搜索，我们发现相比于人类复杂的凋亡通路，日本血吸虫的凋亡通路可能比较简单，许多存在于人类中的凋亡基因在日本血吸虫全基因组数据库中搜索不到对应的完整开放阅读框。其次，通过BLAST搜索，我们发现日本血吸虫凋亡相关基因与人类相应的凋亡基因的相似性大都在30%左右，在进化上属于亲缘关系较远，但仍属于同源的范畴。最终，我们共找到15个日本血吸虫与凋亡相关的基因。通过对鉴定获得的15个基因的进一步分析，可以明确日本血吸虫至少存在一条完整但相对简单的内源性凋亡通路，即线粒体通路。虽然日本血吸虫也存在外源性通路的相关受体，如SjTNFR，但我们还没有发现与TNFR胞内区相互作用的接头分子，仍无法确定日本血吸虫是否存在一条外源性的凋亡通路，Lee等[8]也得出相似的结论。因此更多关于日本血吸虫外源性凋亡通路分子的鉴定仍需要进一步深入的研究。

图1　大、小鼠来源日本血吸虫凋亡相关基因表达量Fig. 1　Apoptosis-associated genes of S. japonicum from Wistar rats and BALB/c mice respectively

流行病学调查显示大鼠为日本血吸虫的非适宜性宿主，相比于适宜性宿主小鼠来说，大鼠体内的虫体生长发育状况差，对宿主的病理性损伤小。研究表明不同适宜性宿主来源日本血吸虫呈现的细胞凋亡差别是造成上述差异的重要原因之一[6]，然而其中哪些凋亡相关基因和凋亡通路参与及其作用机制仍鲜有报道。本研究通过荧光定量PCR对大、小鼠来源的32d日本血吸虫的凋亡相关基因的表达情况进行了比较分析，为填补这方面的空白积累了知识。

我们发现15个凋亡相关基因仅有4个（API、BAX、BIRP和CYC）在大、小鼠来源的32 d日本血吸虫虫体中的表达差异不具有显著统计学意义，其余11个基因在两种宿主来源的32 d日本血吸虫中表达水平差异均具有显著统计学意义。前期研究表明大鼠和小鼠来源日本血吸虫细胞凋亡存在差异[9]，这些凋亡相关基因的差异表达可能是造成两种宿主来源虫体细胞凋亡现象不同的分子机制之一。进一步分析表明，32 d日本血吸虫凋亡相关基因有11个基因（CASP7、IAP、BCL-2、TNFR、AIF、ATM、CASP3、CASP9、APAF、BAK和CIAP）在大、小鼠来源的虫体中的表达差异具有显著性统计学意义，其中有10个基因（BCL-2、TNFR、AIF、ATM、API、CASP3、CASP9、APAF、BAK和CIAP）在大鼠来源虫体中高表达，仅1个基因（CASP7）在小鼠来源虫体中高表达。结果说明在日本血吸虫32 d成虫过程中，凋亡相关基因的差异表达可能是影响日本血吸虫在非适宜性宿主—大鼠体内生长发育的重要因素之一。通过对这些差异表达的凋亡相关基因的深入研究可能有助于我们进一步了解日本血吸虫的生长发育机制，同时这些凋亡相关基因也可能作为治疗血吸虫病的新药物靶标。本研究中凋亡相关基因序列比对分析表明，日本血吸虫凋亡相关基因与人类相应的凋亡基因的相似性，大都在30%左右，一些基因在蛋白结构或表达量上与宿主存在的差异，使它们具有了作为血吸虫新药物靶标的潜力。Kumar等[10]通过生物信息学分析表明血吸虫CASP3/7与人类的CASP3/7在蛋白结构上存在一定的差异，分析得出这些结构上的差异正是血吸虫CASP3/7作为新药靶的基础。

本研究建立了日本血吸虫全基因组本地BLAST数据库，并搜索到15个与日本血吸虫凋亡相关的基因。通过分析大鼠和小鼠来源的32 d日本血吸虫中15个凋亡相关基因的表达情况，进一步鉴定了不同宿主来源的日本血吸虫中细胞凋亡的差异表达基因，为进一步阐明日本血吸虫与不同适宜性宿主的相互作用机制及日本血吸虫新药物靶点的筛选提供了基础。

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[9] 郭小勇. 日本血吸虫细胞凋亡的初步观察[D]. 北京: 中国农业科学院, 2014.

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COMPARISON OF APOPTOSIS-ASSOCIATED GENES IN SCHISTOSOSMA JAPONICUM FROM WISTAR RAT AND BALB/C MOUSE

WANG Tao, HONG Yang, FU Zhi-qiang, CAO Xiao-dan, LV Chao, DOU Xue-feng, XU Rui, HAN Qian, JIA Bing-guang, ZHAO Zhi-xin, LIN Jiao-jiao

(Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veternary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Schistosoma japonicum (S. japonicum) could infect more than 40 species of animals naturally. of which Mice are susceptible host to S. japonicum while rats are less-susceptible. Previous study have showed that apoptosis was one of the most important factors affect the development of S. japonicum in different susceptible host. However, what genes involved in the apoptosis pathway of S. japonicum? Which apoptosis associated genes might affect the development of S. japonicum. Still few study focused on these questions. The study built the whole genome BLAST database of S. japonicum fi rstly and dig out 15 apoptosis genes of S. japonicum using similarity search with human apoptosis genes. Meanwhile, 32 d S. japonicum worms from Wistar rats and BALB/c mice were collected separately. Real-time PCR analysis the expression level of these apoptosis associated genes in those worms. The results further identifi ed the different expression apoptosis associate genes in S. japonicum worms from different susceptible host and provided the foundation for proceeding further research on parasite-host interaction.

Apoptosis; apoptosis genes; local BLAST

S852.735

A

1674-6422（2016）03-0055-05

2016-03-18

国家自然科学基金（81271871、31172315）

王涛，男，硕士研究生，预防兽医学专业

林矫矫，E-mail：jjlin@shvri.ac.cn