弓形虫卵囊壁蛋白OWP1的重组表达和特异性单克隆抗体制备

白　宇，李培德，胡景炎，何　杰，陈欢利，吴春琴，金俊杰

（温州科技职业学院，温州 325006）

弓形虫卵囊壁蛋白OWP1的重组表达和特异性单克隆抗体制备

白宇，李培德，胡景炎，何杰，陈欢利，吴春琴，金俊杰

（温州科技职业学院，温州 325006）

为研究制备弓形虫卵囊壁蛋白和特异性单克隆抗体，以弓形虫弱毒株ME49株DNA为模板，应用PCR技术扩增卵囊壁蛋白OWP1基因，将其克隆至原核表达载体构建重组表达质粒 pET-28a-OWP1，经过IPTG 诱导表达和His纯化树脂纯化重组蛋白His-OWP1。重组蛋白His-OWP1作为免疫原，免疫7周龄雌性BALB/c小鼠，重组蛋白GST-OWP1作为检测筛选抗原，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备弓形虫卵囊壁蛋白OWP1的单克隆抗体。结果表明，获得2株稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株（4A2和2C10）。Western blot结果表明研究制备的单克隆抗体能够识别重组表达蛋白。制备获得的2株稳定性好、效价高的单克隆抗体，可为今后研究特异敏感的弓形虫病血清学检测方法提供材料。

弓形虫；卵囊壁蛋白1；重组表达；单克隆抗体

弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种呈世界性分布的人畜共患寄生虫病。弓形虫属顶端复合物亚门、孢子虫纲、真球虫目的细胞内寄生性原虫。在其生活史中总共分为滋养体、包囊、裂殖体、配子体和卵囊5种形态，在终宿主（猫与猫科动物）体内，上述5种形态俱存[1]。人类弓形虫感染率极高，全球有20%～50%的人感染弓形虫[2]。我国平均弓形虫阳性率为7.88%，部分地区有逐渐升高的趋势[3]。弓形虫对于免疫抑制或免疫功能低下人群可引起严重的疾病。此外，弓形虫可引起孕妇流产、早产、死胎和畸胎等[4,5]。在动物方面，人、畜、禽和鱼类等其他动物为其中间宿主[6,7]，猫科动物为其终末宿主，猫吃了含有弓形虫包囊的动物组织和发育成熟的卵囊后，进入猫的消化道，侵入肠上皮细胞，通过裂殖体生出大量的裂殖子，部分裂殖子进行配子生殖转化为配子体及大小配子，最后形成卵囊。卵囊会随猫的粪便排到体外，在外界适宜环境中，经过孢子增殖发育为含有两个孢子囊的感染性卵囊。污染水源与食物等外界环境，引起人和动物弓形虫感染[8]。动物是弓形虫病流行的主要传播者，尤其是与人类关系紧密接触的猫在弓形虫病的传播过程中起着非常重要的作用，充分了解猫的弓形虫发病及其感染情况具有重要的现实意义。

目前，弓形虫病的诊断方法主要有病原学检查（镜检观察），免疫学检查（ELISA与间接血凝等[9]）与分子生物学（PCR等[10]）等方法；而针对于弓形虫卵囊的诊断方法只有病原学与分子生物学检查方法，镜检观察对于少量感染虫体的病料较难观察，容易漏检；PCR等生物学方法首先要纯化并破碎卵囊，由于卵囊壁很厚，不易破碎而难于提取出虫体DNA，所以临床上会出现漏检，同时DNA容易被污染而出现假阳性等现象，并且操作过程较复杂，仪器要求高[11,12]。因此，建立一种简便、快速、敏感、特异的弓形虫卵囊感染的实时监测方法非常必要。

本研究拟从检测弓形虫卵囊感染的角度，通过重组表达卵囊壁蛋白OWP1，制备特异性单克隆抗体，对单抗进行一系列特征化鉴定，建立检测感染性卵囊的Western blot检测方法。研究制备的重组卵囊壁蛋白和特异性抗体，可为进一步建立间接免疫荧光检测（indirect immunofluorescence assay，IFA）等血清学诊断技术提供基础，进而可以监测感染样品中弓形虫卵囊的存在和数量，方便临床检测猫及其他污染物的弓形虫卵囊感染情况。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1虫体核酸、实验动物、载体和细胞株弓形虫弱毒株ME49虫体DNA由本实验室制备保存；7周龄雌性 BALB/c 小鼠购自温州医科大学实验动物中心；pET-28a载体、GST-OWP1重组蛋白和SP2/0细胞由本实验室保存。

1.1.2主要试剂PCR反应试剂、DNA Marker（DL2000、DLl5000）、IPTG、蛋白质Marker、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶和限制性内切酶（EcoRΙ，XhoΙ）购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；E. coli DH5α感受态细胞和表达宿主菌BL21（DE3）购自北京全式金生物技术有限公司；His-Affinity Agarose beads树脂和GST Agarose beads树脂购自上海悦克生物科技有限公司；DMEM 和胎牛血清购自Gibco公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；弗氏完全佐剂（FCA）和弗氏不完全佐剂（FICA）、PEG1450、HT和HAT均购自Sigma公司；TMB底物显色液购自Solarbio 公司。

1.2方法

1.2.1引物设计根据GenBank中登录的基因序列（序列号：XM_002367673），利用Oligo6.0软件设计1对引物。引物上游引入EcoRΙ酶切位点，下游引入XhoΙ酶切位点，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。OWP1-F：5′-TT GAA TTC AAC CCT GGA GTG CCT CCT GTG-3′ OWP1-R：5′-AA CTC GAG CTA GAG CTT CTT TTT GCC GTT-3′。

1.2.2PCR扩增目的基因和构建重组表达载体以弓形虫弱毒株ME49 DNA为模板，常规PCR扩增OWP1基因，目的基因定向克隆至原核表达载体pET-28a中，利用EcoRΙ和XhoΙ双酶切鉴定。

1.2.3重组蛋白的诱导表达、纯化和SDS-PAGE分析将鉴定正确的重组质粒pET-28a-OWP1转化宿主菌BL21（DE3），37℃震荡培养过夜；接种新的培养基后，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，37℃震荡5 h进行诱导表达，收集菌体沉淀经超声破碎菌体，离心后分别取上清液和沉淀，SDS-PAGE检测重组蛋白OWP1的表达情况。采用His-Agarose beads树脂纯化OWP1蛋白，纯化后经SDS-PAGE电泳分析鉴定纯化产物。

1.2.4重组蛋白Western blot检测将SDS-PAGE凝胶电泳蛋白条带转印到 N C 膜上，用PBST（含0.05% Tween-20）洗膜3次，每次5 min；加入 5% 脱脂奶粉封闭后加入His-tag 单克隆抗体（按照1:3000 比例稀释），室温孵育 1 h；PBST洗膜3次，每次5 min，加入 1:5000比例稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体，室温孵育1 h；洗涤后置DAB显色液中显色，待条带清晰后迅速用ddH2O终止显色。

1.2.5动物免疫与细胞融合按照常规免疫方案对7周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫。首次免疫按每只小鼠100 μg剂量的抗原与等体积FCA乳化，颈背部皮下多点注射。间隔20 d，将FCA换成FICA，以剂量减半的方法进行二免及免疫推进。细胞融合前3 d进行加强免疫，取不加佐剂的100 μg剂量抗原经腹腔注射。常规方法进行细胞融合，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数4:1混合，1000×g 离心10 min；将沉淀细胞块轻弹成糊状，37℃水浴3 min；将预热的50% PEG融合剂在1 min内轻轻滴入，37℃静置90 s；缓慢滴入预热的DMEM培养液并补加至30 mL，以终止融合剂的融合作用，1000×g离心7 min；用HAT选择培养基重悬细胞沉淀，分别接种于预先铺有饲养细胞的96孔细胞培养板（100 μL/孔），置于CO2培养箱中培养约7～10 d，更换HT培养基继续培养。

1.2.6建立间接ELISA检测方法及阳性杂交瘤筛选亚克隆采用方阵滴定法建立间接ELISA抗体检测方法，检测和筛选阳性克隆细胞孔。检测抗原为GSTOWP1蛋白（200 μg/mL）进行400倍稀释后包被酶标板，以待检的杂交瘤细胞培养上清液作为一抗，SP2/0细胞上清和1:200稀释的免疫小鼠多抗血清分别作为阴阳性对照，ELISA反应读取OD450值，以P/ N≥2.1判定为阳性，以P/N≥2.1的最大稀释度作为抗体效价。待融合细胞生长至覆盖孔底10%～20%时，采用有限稀释法，进行3次细胞亚克隆纯化，克隆筛选获得稳定分泌抗OWP1的单克隆抗体细胞株。

1.2.7制备单抗腹水与Western blot检测应用单抗腹水按照常规方案制备，选择10周龄雌性BALB/c小鼠每只腹腔注射0.5 mL FICA处理，1周后每只小鼠腹腔注射0.5 mL细胞悬液，约含5×105～10×105个细胞。接种后10 d左右，待小鼠腹腔明显膨大，无菌采集腹水，离心分装，-40℃低温保存备用。His-OWP1和GST-OWP1重组蛋白SDS-PAGE电泳后，转印NC 膜，分别以2株单抗腹水作为一抗，HRP-羊抗鼠IgG作为二抗进行Western blot鉴定。

2　结果

2.1卵囊壁蛋白OWP1基因扩增与重组表达载体pET-28a-OWP1酶切鉴定OWP1基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得大小1500 bp目的片段（图1）。重组表达载体 pET28a-OWP1经EcoRΙ和XhoΙ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示两条大小约为5369 bp和1500 bp，与预期大小一致，见图2。

图1　弱毒株ME49株OWP1基因PCR扩增Fig. 1　PCR-amplifi ed OWP1 gene from ME49 strain

图2　重组表达载体pET28a -OWP1的酶切鉴定Fig. 2　Identifi cation of recombinant pET28a -OWP1 by restriction enzyme digestion

2.2重组蛋白His-OWP1纯化分析和Western blot检测通过His纯化树脂对目的蛋白进行纯化，取样经过SDS-PAGE电泳分析，得到单一条带，说明成功获得纯化蛋白，见图3。利用His单抗Western blot检测His-OWP1重组蛋白，在56 kDa处出现一条清晰的反应条带（图4），说明重组蛋白在大肠杆菌中得到正确表达，并且具有反应原性。

图3　OWP1重组蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 3　Analysis of the recombinant OWP1 protein by SDS-PAGE

图4　利用His单抗对OWP1重组蛋白的Western blot检测Fig. 4　Western blot analysis of the recombinant OWP1 protein using anti-His-tag mAb

2.3杂交瘤细胞株的筛选经4次免疫后，选择免疫效果优秀小鼠（血清1万倍稀释后ELISA检测OD450≥1.0），腹腔加强免疫3 d后进行细胞融合，经过3次亚克隆筛选，获得2株能稳定分泌抗OWP1单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为4A2和2C10。

2.4单克隆抗体效价检测将杂交瘤细胞培养上清和单抗腹水分别稀释3200倍和20万倍，ELISA测定显示OD450均大于0.4（阴性对照OD450≤0.15），因此可认定细胞培养上清和腹水抗体效价分别达到3200和20万倍以上。结果见表1。

表1　杂交瘤细胞上清和腹水单抗效价的测定Table 1　Determination results of OWP1 mAb titer of cell supernatant and ascetics fl uid by ELISA

2.5单抗腹水Western blot检测重组蛋白OWP1纯化的重组蛋白His-OWP1和GST-OWP1 经SDS-PAGE电泳并且转膜后，分别以2株单抗腹水作为一抗，HRP-羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot，均可见明显反应带，说明2株细胞株分泌抗体均能与重组OWP1蛋白发生特异性免疫反应，结果见图5。

图5　利用4A2和2C10对OWP1重组蛋白的Western blot检测Fig. 5　Western blot analysis of recombinant protein OWP1 using 4A2 and 2C10

3　讨论

通过GenBank数据库查找到弓形虫卵囊相应的目标蛋白序列，进行卵囊壁蛋白OWP1体外重组表达，经SDS-PAGE电泳鉴定得到纯化的重组蛋白，之后免疫实验动物制备了单克隆抗体。经杂交瘤细胞株筛选、单抗效价测定以及Western blot检测，最终获得了特异性强、敏感性高的两株单克隆抗体。Western blot检测结果显示，两株单抗反应的条带都是单一的，并且抗体效价也非常高。

本研究选取了卵囊壁蛋白OWP1，此蛋白为弓形虫几种卵囊壁蛋白中表达量很高的蛋白，表达后分泌在卵囊的表面，利用OWP1单抗可以敏感、特异的识别该蛋白，从而为我们进一步建立检测卵囊的IFA诊断技术奠定基础。IFA技术不仅操作简单，便于观察，而且还可以通过荧光点来定量病料中卵囊的数量，从而为临床诊断和治疗提供依据。

人类及其他动物感染弓形虫的来源主要有两个：一是弓形虫组织包囊，通过摄取未煮熟含包囊的肉类；二是弓形虫卵囊，通过接触猫或是摄取被含卵囊的猫粪污染的食物和水而受到感染[12]。卵囊主要随猫的粪便排出体外，每个卵囊里含有两个圆形的孢子囊，每个孢子囊内含4个长而弯曲的小孢子。猫作为弓形虫的终末宿主，感染后所排放的卵囊数量惊人，每次可达几千万个甚至上亿个，并且持续排卵达4～8 d。卵囊对外环境抵抗力强，50℃30min；70℃ 2min；90℃ 30s才能杀灭，在环境中的感染力可维持1年以上。因此，猫对弓形虫病的传播起着至关重要的作用[1]。近些年来随着宠物热的升温，猫与人类的接触越来越密切。猫粪便中卵囊检出率25%～100%[13]。因饲养猫而感染弓形虫的机率较不饲养猫者高出3～4倍[14]。因此对猫排放弓形虫卵囊进行有效监控显得尤为重要，通过检测猫弓形虫卵囊感染率可为弓形虫病的预防和治疗提供更多依据。

弓形虫在猫肠上皮细胞内进行有性繁殖，之后形成和排放卵囊。由于目前对卵囊不能进行人工培养，只能从猫的粪便中通过纯化获得，因此，针对卵囊壁特异性蛋白成份的研究很少[15]。有研究认为微腺体蛋白4（MIC4）与卵囊壁的形成有关[16]，而更多卵囊蛋白功能的挖掘还有待进一步研究，寻找更特异敏感的卵囊壁蛋白将是我们进一步的研究方向。

在后续研究中，我们将应用这2株特异性单克隆抗体，建立一种检测弓形虫卵囊的IFA免疫学检测技术，从而能简便、快速、敏感、特异的检测到弓形虫卵囊的存在和数量，进而克服以往病原学检测难和PCR检测步骤繁琐且特异性差的缺点，方便临床检测猫及其他污染物中弓形虫卵囊感染情况，同时还可以对水及水源饮料、食物进行检测。此外，我们将探索能否应用单抗作为抗体药物，阻断弓形虫的繁殖与传播，从而为弓形虫病的预防和治疗提供更多依据。

[1] 于恩庶. 中国弓形虫病[M]. 香港: 亚洲医药出版社. 2000, 31-57.

[2] Jones J L, Dubey J P. Foodborne toxoplasmosis[J]. Clin Infect Dis, 2012, 55(6): 845-851.

[3] Xiao Y, Yin J, Jiang N, et al. Seroepidemiology of human Toxoplasma gondii infection in China[J]. BMC Infect Dis, 2010, 10: 4.

[4] Lanjewar D N, Surve K V, Maheshwari M B, et al. Toxoplasmosis of the central nervous system in the acquired immunodeficiency syndrome[J]. Indian J Pathol Microbiol, 1998, 41(2): 147-151.

[5] Luft B J, Remington J S. Toxoplasmic encephalitis in AIDS[J]. Clin Infect Dis, 1992, 15(2): 211-222.

[6] Montoya J G, Liesenfeld O. Toxoplasmosis[J]. Lancet, 2004, 363(9425): 1965-1976.

[7] Zhang M, Yang Z, Wang S, et al. Detection of Toxoplasma gondii in shellfish and fish in parts of China[J]. Vet Parasitol, 2014, 200(1-2): 85-89.

[8] 路燕. 动物寄生虫病防治[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2012: 229-232.

[9] 郑世英，郑芳，李士平, 等. 山东省部分地区犬猫弓形虫病流行情况调查[J]. 中国兽医杂志, 2015, 51(3): 74-75.

[10] Kourenti C and Karanis P. Evaluation and applicability of a purification method coupled with nested PCR for the detection of Toxoplasma oocysts in water [J]. Lett appl Microbiol, 2006, 43: 475-481.

[11] Herrmann D C, Maksimov A, Pantchev N, et al. Comparison of different commercial DNA extraction kits to detect Toxoplasma gondii oocysts in cat faeces[J]. Berl Munch Tierarztl Wochenschr, 2011, 124(11-12): 497-502.

[12] Dubey J P. Toxoplasma gondii oocyst survival under defined temperatures[J]. J Parasitol, 1998, 84(4): 862-865.

[13] 陈昌源. 家养宠物与人群弓形虫感染情况的研究[J].中国人兽共患病杂志, 2001, 17(1): 76-77.

[14] 郭永和，刘永春，秦剑. 女性不孕症与弓形虫感染关系的探讨[J]. 济宁医学院学报, 2001, 24(1): 62.

[15] Possenti A, Cherchi S, Bertuccini L, et al. Molecular characterisation of novel family of cysteine-rich proteins of Toxoplasma gondii and ultrastructural evidence of oocyst wall localisation[J]. Int J Parasitol, 2010, 40(14): 1639-1649.

[16] Ferguson D J, Brecht S, Soldati D. The microneme protein MIC4, or an MIC4-like protein, is expressed within the macrogamete and associated with oocyst wall formation in Toxoplasma gondii[J]. Int J Parasitol, 2000, 30(11): 1203-1209.

RECOMBINANT EXPRESSION AND PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO OOCYST WALL PROTEIN 1 OF TOXOPLASMA GONDII

B AI Yu, LI Pei-de, HU Jing-yan, HE Jie, CHEN Huan-li, WU Chun-qin, JIN Jun-jie
(Wenzhou Vocational College of Science & Technology, Wenzhou 325006, China)

In order to obtain specifi c monoclonal antibodies against oocyst wall protein 1 (OWP1) of Toxoplasma gondii, the recombinant plasmid pET-28a-OWP1 containing the OWP1 gene was constructed and transformed into BL21 cells. The fusion protein was expressed in BL21 with the induction of IPTG. The recombinant OWP1 protein was purifi ed and emulsifi ed in Freund's adjuvant for immunization of BALB/c mice. The monoclonal antibodies (mAbs) were prepared by fusing mouse myloma cells (SP2/0) with the spleen cells from immunized BALB/c mice. Two hybridoma cell lines secreting mAbs were identifi ed by screening in indirect ELISA and designated as 4A2 and 2C10, respectively. Both mAbs specifi cally reacted in Western blot with recombinant OWP1 of Toxoplasma gondii. The future research will examine if these Mabs can be used for development of diagnostic methods for Toxoplasmosis and investigation into the pathogenecity of Toxoplasma gondii.

Toxoplasma gondii; ocyst wall protein 1(owp1); recombinant expression; monoclonal antibody

S852.723

A

1674-6422（2016）03-0060-06

2016-02-29

温州市公益性技术研究项目（N20150027）；浙江省公益性技术研究农业项目（2014C32046）

白宇，男，博士，助理研究员，主要从事弓形虫病研究

金俊杰，E-mail：jjjaabbaann@163.com