流产布鲁菌ppdk基因缺失株的构建及其生物学特性分析

高建鹏，田明星，鲍衍清，李　朋，刘佳萌，王少辉，丁　铲，于圣青

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

流产布鲁菌ppdk基因缺失株的构建及其生物学特性分析

高建鹏，田明星，鲍衍清，李朋，刘佳萌，王少辉，丁铲，于圣青

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的呈全球性分布的人畜共患细菌性传染病。布鲁菌是一种兼性胞内菌，感染宿主依赖多种基因的表达和调控。近年来，胞内菌的碳代谢与致病力的关系成为研究的热点。前期研究发现碳代谢相关的丙酮酸磷酸双激酶（ppdk）基因与布鲁菌毒力相关。本研究利用同源重组方法构建流产布鲁菌ppdk基因缺失株，通过环境压力因子耐受性实验、胞内存活实验和动物致病性实验等探讨ppdk基因对布鲁菌毒力的影响。结果显示，ppdk基因缺失能减弱布鲁菌对多粘菌素B和大牛血清的抵抗性，减弱细菌胞内存活的能力和对小鼠的致病力，表明ppdk基因与流产布鲁菌的毒力密切相关。

流产布鲁菌；ppdk基因；毒力

布鲁菌病是一种重要的人畜共患细菌性传染病，病原为布鲁菌，革兰氏染色呈阴性。布鲁菌感染主要导致怀孕动物流产、子宫炎、关节炎和公畜睾丸炎等，感染人可引起类似流感的波状热，转为慢性后，主要表现为关节炎以及生育障碍，较难治愈，对人和动物健康构成重大威胁[1-3]。布鲁菌与其他致病菌相比，无经典的毒力因子，如质粒、荚膜，外毒素等[4]，其毒力主要体现在入侵宿主细胞并在胞内增殖的能力[5]，布鲁菌毒力相关基因的研究一直是国内外学者研究的重点。

近年来，碳代谢对胞内细菌毒力影响的研究成为新的热点，碳代谢调控可能是胞内病原菌适应胞内生存的重要机制，如单核李斯特杆菌中的丙酮酸羧化酶基因（PycA）缺失株，其胞内存活能力和对小鼠的致病性均减弱[6]；在志贺氏菌中与分支酸盐合成相关的aroC和aroD基因、鸟苷一磷酸合成相关的guaA和guaB基因、胸苷酸合成相关的thyA基因均与细菌毒力相关[7,8]；结核杆菌的酰基辅酶A脱氢酶基因（fadE28）、烯酰辅酶A水合酶（echA20）等缺失后均导致细菌毒力显著降低[9]。因此，碳代谢相关基因研究对于阐明胞内菌致病机制具有重要意义。

布鲁菌是一种典型的兼性胞内寄生菌，胞内碳代谢在其致病过程中发挥着至关重要的作用。在前期研究中，我们发现糖异生相关的丙酮酸磷酸双激酶基因（ppdk）与流产布鲁菌的毒力密切相关，该酶可逆催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸。本研究利用同源重组技术构建流产布鲁菌的ppdk基因缺失株，并对其部分生物学特性进行分析，表明ppdk基因是布鲁菌发挥致病性必不可少的基因。本研究为探讨碳代谢在流产布鲁菌致病过程中的作用提供重要参考。

1　材料和方法

1.1质粒、菌种及试剂流产布鲁菌S2308株、小鼠巨噬细胞RAW264.7 由中国农业科学院上海兽医研究所保存；6～8周龄BABL/c品系小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；大豆胰蛋白胨肉汤（TSB）购于BD公司；DH5α、质粒提取试剂盒购自天根（Tiangen）生化科技有限公司；pSC质粒由本课题组构建和保存；Trizol总RNA提取试剂盒购于Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒、Ligation Mix试剂盒以及各种限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司；荧光定量试剂购于Promega公司；TURBO DNA-free kit、胶回收试剂盒、二氧化碳培养箱购自Thermo Fisher公司；生物安全柜购自LABCONCO公司；电转仪购自BIO-RAD公司；摇床购自苏州威尔实验用品有限公司；电泳仪、全自动凝胶图像处理系统购自上海天能科技公司。

1.2引物设计根据GenBank（NC_007618.1）公布的流产布鲁菌S2308株基因组全序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物序列见表1。

表1　本研究中所用引物序列Table 1　Primers used in this study

1.3自杀质粒pSC-ppdk构建参照文献[10]，构建pSC-ppdk自杀质粒。以布鲁菌S2308株基因组为模板，ppdk-UF/ppdk-UR为引物，扩增ppdk基因上游片段（1096 bp）；以ppdk-DF/ppdk-DR为引物，扩增ppdk基因下游（1027 bp）片段。琼脂糖凝胶电泳回收上下游片段。以回收上下游片段为模板，ppdk-UF/ppdk-DR为引物，进行重叠PCR融合上下游片段。胶回收，纯化PCR产物。用限制性内切酶Xba I分别酶切回收产物和pSC质粒（4018 bp）。Liagtion Mix连接酶切产物和pSC质粒，转化DH5α感受态细胞，阳性重组质粒命名为pSC-ppdk质粒。小量中提质粒后，Xba I酶切鉴定自杀质粒，酶切鉴定正确的质粒送至上海英潍捷基公司测序。

1.4ppdk缺失株的构建参照文献[10]，流产布鲁菌S2308株TSB培养至对数期，置于冰水混合物中，冰浴15 min；4℃、6000×g离心5 min，收集菌体；用灭菌去离子水洗涤菌体2遍，10%的甘油水悬浮沉淀，调整菌体浓度为2×1010CFU/mL，100 μL分装；加入0.5～1 μg自杀质粒pSC-ppdk，冰浴10 min，加入电极杯中，在2.4 kV、400Ω条件下将自杀质粒电转化至感受态细菌中，立即加入37℃预热的TSB，体外复苏培养过夜；涂布氨苄抗性TSB平板筛选，将筛选出的单菌落接种至无抗性TSB培养基中培养至对数期；稀释菌液后涂布于含5%蔗糖TSB平板进行筛选，挑取单菌落于无抗性的TSB中培养，PCR鉴定阳性克隆，25%甘油冻存细菌缺失株。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进一步分析ppdk基因缺失对上下游基因是否产生极性效应。

1.5细菌RNA的提取及qRT-PCR分析将流产布鲁菌S2308株和ppdk缺失株培养至对数生长期，取0.2 mL新鲜菌液加入1 mL Trizol裂解液，剧烈震荡，充分裂解，根据试剂盒说明书提 取细菌总RNA。使用TURBO DNA-free kit去除污染基因组，NanoDrop ND-1000分光光度计测定上清中RNA的浓度。取RNA溶液20 μL，参照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行反转录，反转录程序：37℃ 15 min；85℃5s。qRT-PCR反应体系为20 μL，其中，GoTaq qPCR mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL（10 pmol/ μL）、cDNA1 μL，ddH2O补足20 μL。反应条件：95℃预变性 2 min；95℃变性 15 s，60℃退火和延伸 1 min，循环次数40次。以细菌GAPDH基因为内参进行校准，用2-ΔΔCt（Livak）法来计算待测基因转录水平。

1.6生长曲线测定将培养至对数期的野毒株和缺失株稀释至OD600≈1.0，按照1:100比例接种至TSB培养基中，37℃振荡培养，分别于不同时间点取样测定OD600值，每株菌重复3次，计算平均值，绘制细菌的生长曲线。

1.7耐受性试验将野毒和缺失株培养至对数生长中期（OD600≈1.0），用无菌PBS溶液稀释菌液至浓度约为4×105CFU/mL，分别取等体积细菌悬液与待测溶液混合，37℃作用1 h，10倍梯度稀释后涂布TSA平板，37℃培养3～5 d，计数细菌菌落数，以PBS组做对照，计算细菌存活率。双氧水耐受试验用于测定细菌抗氧化应激能力，所用双氧水终浓度为1、2.5、5 mmol/L；多粘菌素B耐受性试验用于测定细菌抗阳性杀菌肽能力，所用多粘菌素B终浓度为50、100、200 μg/mL；大牛血清耐受性试验用于测定细菌抗自然血清杀菌能力，所用大牛血清终浓度为50%，灭活的50%大牛血清做阴性对照。

1.8胞内存活试验小鼠巨噬细胞系 RAW264.7接种于24孔细胞培养板中，每孔接种细胞约5×105个，37℃、5% CO2条件下培养至单层，PBS洗涤细胞2遍，每孔加500 μL DMEM。TSB培养细菌至对数生长期（OD600≈1.0），调整细菌浓度至 4×109CFU/ mL，然后接种至细胞中，接种MOI约为200:1。为保证同步感染，将接种细菌的培养板置于水平离心机中，400×g室温离心5 min，37℃孵育1 h，用DMEM培养基洗涤细胞3次，去除未黏附的胞外细菌，用含有100 μg/mL庆大霉素DMEM培养基孵育2 h杀死未入侵细胞的细菌。用DMEM培养基洗涤细胞3次，此时间点计为2 h。随后更换含有庆大霉素20 μg/mL的DMEM培养基维持细胞，于感染后8、24、48 h去除培养基，PBS洗涤3次，用0.2% Triton X-100裂解细胞，10倍梯度稀释后涂布TSA平板进行细菌菌落计数，比较ppdk缺失株和野毒株胞内存活能力。

1.9小鼠致病性分析参照文献[10]，将野生株、ppdk缺失株接种于TSB中，培养至对数期（OD600≈1.0），用PBS稀释至1×107CFU/mL。将6～8周龄的BABL/c小鼠分为2组，每组12只，分别腹腔注射野毒和缺失株稀释液（0.1 mL/只）。感染后第1周和第5周每组各扑杀老鼠6只，取脾脏称重后，加5 mL 0.2%TritonX-100水研磨脾脏组织，10倍梯度稀释后涂布TSA平板，37℃、5%CO2中培养3～5 d，计算脾脏重量以及脾脏载菌量。

2　结果

2.1质粒构建PCR扩增ppdk基因上游片段大小为1096 bp，下游片段为1027 bp，融合PCR后片段大小为2123 bp，如图1所示，PCR扩增结果与预期结果一致。将自杀质粒pSC-ppdk经XbaΙ酶切鉴定，得到4018 bp和2123 bp两个片段（见图1），并将其送至上海英潍捷基公司测序，测序结果正确，无碱基突变。

图1　自杀质粒的构建Fig. 1　Construction of the suicide plasmid

2.2缺失株构建经过氨苄抗生素和蔗糖两轮筛选，采用内侧引物进行PCR鉴定，鉴定引物扩增位置如图2A所示，结果显示，缺失株无特异性条带扩增，与预期结果一致（图2B），ppdk基因缺失成功。qRT-PCR结果显示缺失株中检测不到ppdk基因的转录，并且ppdk基因的缺失并不影响上下游基因的转录（图2C）。可见，该基因缺失并未对上下游基因转录产生极性效应。

2.3生长曲线测定结果结果显示，ppdk缺失株生长与野毒株略有差异，在生长早期（≤8 h）和对数生长前期（8～20 h），ppdk缺失对布鲁菌生长影响不大，然而，在对数生长中晚期（20～48 h），ppdk缺失株生长明显慢于野生株。当细菌生长达到平台期以后（≥48 h），两者之间无明显差异（图3）。结果表明，ppdk基因的缺失对细菌对数生长中晚期有明显影响(P≤0.05)，对其他生长阶段无影响。

图2　PCR和qRT-PCR鉴定Δppdk缺失株Fig. 2　Identifi cation of the Δppdk mutant by PCR and qRT-PCR

图3　流产布鲁菌S2308株和ppdk缺失株生长曲线测定(*, P≤0.05)Fig. 3　Determination of bacterial growth curves for Brucella S2308 strain and Δppdk mutant (*, P≤0.05)

2.4ppdk缺失株胞内存活试验分析结果显示，与野毒株相比，ppdk缺失株在感染细胞24 h后，其胞内细菌载量明显降低。感染48 h后，二者胞内载菌量差异更加显著，约为10倍差异。可见，ppdk基因缺失影响布鲁菌的胞内存活。

图4　流产布鲁菌S2308株和ppdk缺失株在巨噬细胞内存活测定(***, P≤0.001; ****, P≤0.0001)Fig. 4　Detection of intracellular survival of Brucella S2308 strain and Δppdk mutant in macrophages (***, P≤0.001; ****, P≤0.0001)

2.5耐受性试验结果比较Δppdk和S2308对双氧水、多粘菌素B和大牛血清敏感性发现，ppdk缺失减弱布鲁菌对大牛血清和多粘菌素B的抵抗性（图5A、B），而对双氧水的抵抗性两者差异无明显统计学意义（图5C）。在血清杀菌试验中，ppdk缺失株存活能力明显低于野毒，存活率仅为45%，野毒存活率达到80%左右（图5A）。在多粘菌素B抵抗性试验中，当多粘菌素B浓度为50 μg/mL时，ppdk缺失株存活率仅为20%，显著低于野毒株，随着多粘菌素B浓度的增加，二者差异更为显著（图5B）。

2.6ppdk缺失株对小鼠的致病力分析脾脏是布鲁菌感染的靶器官之一，通常将脾脏肿胀程度和脾脏载菌量作为评价细菌致病力的重要指标[11]。为了进一步分析ppdk基因对布鲁菌毒力的影响，用野毒和缺失株感染成年BABL/c小鼠评价细菌毒力，在感染小鼠1周和5周后，分别测定脾脏重量和脾脏载菌量。结果显示，感染1周后，ppdk缺失株在小鼠体内载菌量显著降低，低于野毒近2log值（约200倍），脾脏重量（肿胀程度）也显著降低，低于野毒约0.1 g。在感染5周时，ppdk缺失株载菌量差异更加显著，低于野毒约6log值，脾脏肿胀差异也更加显著，缺失株感染小鼠脾脏重量低于野毒近0.2 g（图6）。该结果表明，ppdk基因缺失明显减弱布鲁菌对小鼠的致病力。

3　讨论

布鲁菌作为胞内寄生菌，能在感染细胞内获取足够的营养或能量是其营寄生生活的关键。其中，碳代谢是细菌生长所必需的重要代谢途径，据报道，多种碳代谢相关基因与布鲁菌相关。猪种布鲁菌gluP、gnd、rbsK、pyc、pgi等基因缺失明显减弱细菌胞内存活能力[12-14]，羊种布鲁菌的毒力与dbsA、ugpA、glpD及若干赤酰糖醇代谢基因相关[15,16]，而流产布鲁菌gluP、gnd、gltD、gcvB基因的缺失对其致病性同样发挥着重要作用[17-19]，由此可见，碳代谢对布鲁菌完成胞内复制并发挥致病作用起到关键作用。

在前期研究中，我们发现ppdk与布鲁菌毒力相关，本研究对ppdk缺失株的生物学特性进行了分析。ppdk缺失首先影响布鲁菌在对数生长中晚期的生长，在体外营养丰富的TSB培养基中，布鲁菌主要通过葡萄糖酵解途径获取能量，其中ppdk可以催化磷酸烯醇式丙酮酸转化丙酮酸释放1分子ATP，可能在为布鲁菌快速生长提供能量中发挥一定的作用。此外，ppdk又作为糖异生的关键酶，在合成六碳糖中发挥着重要的作用。布鲁菌营胞内寄生偏噬代谢三碳和四碳糖[20,21]。丙酮酸在细胞内贮存丰富，是很多胞内寄生菌利用的主要组分。布鲁菌糖异生途径对于其胞内存活和致病性发挥至关重要作用，ppdk在糖异生中极有可能帮助布鲁菌合成六碳糖，而六碳糖是细菌脂多糖、核糖等分子合成的基本组分，脂多糖在布鲁菌抵抗不利环境压力因子方面发挥重要作用。本研究发现ppdk缺失株减弱对多粘菌素B和自然血清的抵抗性，预示ppdk缺失可能影响布鲁菌外膜结构。据报道流产布鲁菌ppdk缺失株在基础培养基中产生凝集现象[22]，同样预示着布鲁菌外膜结构发生重要变化，与我们报道的结果一致。外膜结构修饰可能改变细菌表面电荷分布，提高了对阳性杀菌肽以及自然血清中补体杀菌的敏感性。这一假设同样解释ppdk在感染小鼠早期减毒的原因，感染早期ppdk缺失株抵抗小鼠体内先天免疫杀菌因子的能力减弱，不能顺利定植于网状内皮组织系统，如肝脏和脾脏等。定植于胞内的细菌不能最优的利用胞内三碳或四碳糖代谢，最终不能在宿主体内建立慢性感染而被清除，这可能是ppdk缺失株毒力减弱的主要原因之一。

图5　布鲁菌耐受性试验(*, P≤0.05; ***, P≤0.001; ****, P≤0.0001)Fig. 5　Tolerance analysis of Brucella(*, P≤0.05; ***, P≤0.001; ****, P≤0.0001)

图6　布鲁菌S2308株和ppdk缺失株对小鼠致病性分析(**, P≤0.01; ****, P≤0.0001)Fig. 6　Analysis of Brucella S2308 strain and Δppdk mutant virulence to mouse (**, P≤0.01; ****, P≤0.0001）

综上所述，本研究通过构建ppdk基因缺失株并测定缺失株的生物学特性，为进一步研究ppdk基因的功能及其胞内菌碳代谢与毒力的相关性提供了重要资料，为布鲁菌代谢缺陷型减毒活疫苗研究奠定了基础。

[1] Boschiroli M L, Foulongne V, O′Callaghan D. Brucellosis: a worldwide zoonosis[J]. CurrOpin Microbiol, 2001, 4(1): 58-64.

[2] Atluri V L, Xavier M N, de Jong M F, et al. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts[J]. Annu Rev Microbiol, 2011, 65: 523-541.

[3] Wang Z, Wu Q. Research progress in live attenuated Brucella vaccine development[J]. Curr Pharm Biotechno, 2013, 14(10): 887-896.

[4]Moreno E, Moriyon I. Brucella melitensis: a nasty bug with hidden credentials for virulence[J]. P Natl Acad Sci USA, 2002, 99(1): 1-3.

[5]Fugier E, Pappas G, Gorvel J P. Virulence factors in brucellosis: implications for aetiopathogenesis and treatment[J]. Expert Rev Mol Med, 2007, 9(35): 1-10.

[6]Schar J, Stoll R, Schauer K, et al. Pyruvate carboxylase plays a crucial role in carbon metabolism of extra- and intracellularly replicating Listeria monocytogenes[J]. J Bacteriol, 2010, 192(7): 1774-1784.

[7]Noriega F R, Losonsky G, Lauderbaugh C, et al. Engineered deltaguaB-A deltavirG Shigella flexneri 2a strain CVD 1205: construction, safety, immunogenicity, and potential efficacy as a mucosal vaccine[J]. Infect Immun, 1996, 64(8): 3055-3061.

[8]Cersini A, Martino M C, Martini I, et al. Analysis of virulence and inflammatory potential of Shigella flexneri purine biosynthesis mutants[J]. Infect Immun, 2003, 71(12): 7002-7013.

[9]Rengarajan J, Bloom B R, Rubin E J. Genome-wide requirements for Mycobacterium tuberculosis adaptation and survival in macrophages[J]. P Natl Acad Sci USA, 2005 , 102(23): 8327-8332.

[10]田明星. 流产布鲁氏菌毒力基因筛选鉴定及其功能研究 [D].北京: 中国农业科学院, 2014.

[11] 张敏, 韩先干, 田明星, 等. 流产布氏杆菌rfbD基因缺失株 的构建及其生物学特性[J]. 中国兽医科学. 2013, (5): 446-452.

[12] Kohler S, Ouahrani-Bettache S, Layssac M, et al. Constitutive and in ducible expression of green fluorescent protein in Brucella suis[J]. Infect Immun, 1999, 67(12): 6695-6697.

[13] Kohler S, Foulongne V, Ouahrani-Bettache, et al. The analysis of theintramacrophagic virulome of Brucella suis deciphers the environment encountered by the pathogen inside the macrophage host cell[J]. P Natl Acad Sci USA, 2002, 99(24): 15711-15716.

[14] Foulongne V, Bourg G, Cazevieille C, et al. Identification of Brucel la suis genes affecting intracellular survival in an in vitro human macrophage infection model by signaturetagged transposon mutagenesis[J]. Infect Immun, 2000, 68(3): 1297-1303.

[15] Lestrate P, Delrue R M, Danese I, et al. Identification and characte rization of in vivo attenuated mutants of Brucella melitensis[J]. Mol Microbiol, 2000, 38(3): 543-551.

[16] Wu Q, Pei J, Turse C, et al. Mariner mutagenesis of Brucella meliten sis reveals genes with previously uncharacterized roles in virulence and survival[J]. BMC Microbiol, 2006, 6: 102.

[17] Essenberg R C, Candler C, Nida S K. Brucella abortus strain 2308 putat ive glucose and galactose transporter gene: cloning and characterization[J]. Microbiology, 1997 143 (Pt 5): 1549-1555.

[18] Hong P C, Tsolis R M, Ficht T A. Identification of genes required f or chronic persistence of Brucella abortus in mice[J]. Infect Immun, 2000, 68(7): 4102-4107.

[19] Eskra L, Canavessi A, Carey M, et al. Brucella abortus genes id entified following constitutive growth and macrophage infection[J]. Infect Immun, 2001, 69(12): 7736-7742.

[20] Barbier T, Nicolas C, Letesson J J. Brucella adaptation and survivalat the crossroad of metabolism and virulence[J]. FEBS Lett, 2011, 585(19): 2929-2934.

[21] Barbier T, Collard F, Zuniga-Ripa A, et al. Erythritol feeds the pen tose phosphate pathway via three new isomerases leading to D-erythrose-4-phosphate in Brucella[J]. P Natl Acad Sci USA, 2014, 111(50): 17815-17820.

[22] Zuniga-Ripa A, Barbier T, Conde-Alvarez R, et al. Brucella abortus d epends on pyruvate phosphate dikinase and malic enzyme but not on Fbp and GlpX fructose-1,6-bisphosphatases for full virulence in laboratory models[J]. J Bacteriol, 2014, 196(16): 3045-3057.

CONSTRUCTION AND BIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF A PPDK MUTANT OF BRUCELLA ABORTUS

GAO Jian-peng, TIAN Ming-xing, BAO Yan-qing, LI Peng, LIU Jia-meng, WANG Shao-hui, DING Chan, YU Sheng-qing

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Brucellosis caused by Brucella spp. has been one of the most prevalent bacterial zoonosis worldwide. The etiological agent is a facultative intracellular bacterium, and infects hosts depending on the expression and regulation of virulence genes. Recently, one research hotpot is about links between carbon metabolism and virulence for intracellular bacteria. In our previous study, we found that a metabolism related pyruvate phosphate dikinase (ppdk) encoded by ppdk gene was associated with Brucella virulence. In this study, we constructed a ppdk mutant via homologous recombination method. In order to study the function of ppdk gene on Brucella virulence, we tested its resistance to environmental stress factors, survival within RAW264.7 cells and pathogenecity to BALB/c mice. As compared with the wild-type parent strain S2308, the ppdk mutant was more sensitive to polymyxin B and natural bovine serum, decreased survival ability within RAW264.7, and attenuated virulence in mice, suggesting that ppdk gene plays a crucial role on the Brucella virulence.

Brucella abortus; ppdk gene; virulence

S852.614

A

1674-6422（2016）03-0027-08

2016-03-16

中国农业科学院科技创新工程专项经费(SHVRI-ASTIP-2014-8)；中国博士后科学基金面上资助(2015M570184)；中央级公益性科研院所基本科研业务费(2016JB06)

高建鹏，男，硕士研究生，预防兽医学专业

于圣青，E-mail：yus@shvri.ac.cn