酶法制备多肽-Fe的体内抗氧化功能研究

孔 宇，韩 冉，王汝华，陈 文，刘常金

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

酶法制备多肽-Fe的体内抗氧化功能研究

孔 宇，韩 冉，王汝华，陈 文，*刘常金

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

研究了猪血血红蛋白经酶解制备的多肽-Fe对小鼠体内抗氧化作用，分别测定血清中的ALT，AST，肝脏中的GSH-Px，蛋白质，SOD，MDA。结果表明，多肽-Fe可以降低由于肝脏损伤而引起的血清中AST和ALT含量的升高，同时可抑制肝脏中GSH-Px活力降低，很好地抑制小鼠肝组织中MDA的形成及肝损伤后SOD代偿性升高。HE染色结果表明，多肽-Fe可在一定程度上改善CCl4造成的肝损伤。

猪血血红蛋白；多肽-Fe；体内抗氧化

0 引言

2014年我国猪肉产量达5 671×108t［1］，是全球产量最高的国家，同时我国也是世界上猪肉销量最大的国家。猪肉生产过程中会产生大量的副产物，2014年我国因屠宰而产生的猪血为184×108t［2］。猪血中富含丰富的蛋白质、微量元素，并且它的脂肪和糖含量并不高，具有很高的营养价值。作为食品工业副产物［3］，由于生产条件限制，我国在猪血开发利用方面形式比较单一［4］。酶法制备多肽-Fe，对猪血进行加工，既可以使血液得到充分利用，又可提高产品的附加值，减少因猪血废弃而对环境带来的污染。本试验通过在新鲜猪血中添加一定量的胰蛋白酶，对猪血中的血红蛋白进行酶解，将得到的酶解物进行分离、提纯，得到所需多肽-Fe。对得到的多肽-Fe进行体内抗氧化性研究试验，结果表明猪血经过酶解制备的多肽-Fe具有较好的体内抗氧化性，为酶法制备多肽-Fe提供了一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

将采集到的新鲜猪血中添加适量柠檬酸钠抗凝。将处理后的血液离心，转速为4 000 r/min，弃去上清液，沉淀即为血红细胞。将得到的血红细胞溶于一定体积的蒸馏水中，在磁力搅拌器中搅拌30 min，使细胞混合均匀，之后对血红细胞进行离心，转速为4 000 r/min，离心时长20 min，取上层清液。将上层清液置于60℃摇床中进行避光加热，加热时长30 min，将所得溶液于转速3 000 r/min下离心15 min，取上层清液，得到纯度较高的血红蛋白。将得到的血红蛋白溶液置于摇床中，于95℃下加热15 min，使血红蛋白变性。其中，胰蛋白酶添加量为1%，血红细胞与蒸馏水的配比为1∶4（V∶V），酶解温度为50℃，溶液的pH值为8，经过5 h的酶解，将得到的溶液用4 mol/L氢氧化钠调pH值为6～7进行沉淀，沉淀收集冻干即为所制备多肽-Fe。

1.2 试验动物

昆明种小白鼠，清洁级动物，6～8周，同批试验选用同一性别小鼠，体质量20～22g，由中国人民解放军军事医学科学院试验动物中心提供，许可证号：SCXK-（军）2002-001。

1.3 试剂

猪血，天津市文详屠宰场提供；CCl4，天津江天化工技术有限公司提供；胰蛋白酶，诺维信（中国）生物技术有限公司提供；考马斯亮蓝G-250，国药集团化学制剂有限公司提供；谷丙转氨酶（ALT）试剂盒、谷草转氨酶（AST）试剂盒，上海超研生物科技有限公司提供；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px） 试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成生物工程中心提供。

1.4 试验仪器

ESJ205-4型电子天平、TGL-16B型台式离心机、电热恒温水浴锅、SP-2102UV型紫外可见分光光度计、pH自动滴定仪、JR-2型集热式磁力加热搅拌器、Nikon 90i型显微镜。

1.5 方法

1.5.1 CCl4急性肝损伤模型的建立

选用30只雌性小白鼠并随机分成3组，分别为正常组、模型组和给药组。给药组每天灌胃1.071 kg的多肽-Fe溶液（溶于生理盐水中）；正常组和模型组灌胃等量的生理盐水。灌胃8周后，模型组及给药组腹腔分3 d注射0.2%CCl4（四氯化碳）食用油溶液0.1 mL/10g，正常组给植物油，给药组继续给予受试物至试验结束（与CCl4灌胃间隔 4 h以上）。

1.5.2 取样

末次注射后，禁食16～20 h。对小鼠进行眼球取血并分离血清，测各项血液生化指标。摘取肝脏，用0.9%生理盐水冲洗血迹，用滤纸吸取多余水分，将收集到的肝脏分为2部分，其中一部分冷冻后制成肝匀浆，测定各项指标；另一部分用10%甲醛固定进行病理组织学光学镜观察。

1.5.3 生化指标测定

谷丙转氨酶（ALT）活性测定：测定方法参见文献［5］；谷草转氨酶（AST）活性测定：测定方法参见文献［5］；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性测定：测定方法参见文献［5］；蛋白含量测定：考马斯亮蓝法；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定：黄嘌呤氧化酶法［6］；丙二醛（MDA）含量的测定：TBA法［6］。

1.5.4 肝脏形态学观察

采用HE染色法。

肝脏剪碎成小块，用0.9%生理盐水洗净，甲醛固定液固定，然后进行包埋、切片、展片、分片、捞片、烘片、HE染色、切片脱水、封片等工艺，用光学显微镜对制备好的切片进行观察［7］。

2 结果和讨论

2.1 试验小鼠肝脏形态学观察

小鼠肝脏形态学观察见图1。

图1 小鼠肝脏形态学观察

由图1可知，正常组小鼠肝脏形状饱满、颜色鲜艳、被膜光滑、轮廓清晰；模型组小鼠肝脏颜色灰暗、肝脏肿大、表面粗糙，表面有大量出血点，感官质地无弹性、易破碎；给药组小鼠的肝脏较模型组小鼠肝脏表面的出血点少，且有光泽，肝小叶轮廓较清晰。通过对肝脏外观的观察，发现多肽-Fe可降低由自由基造成的肝损伤。

2.2 多肽-Fe对试验小鼠血清中ALT，AST的影响多肽-Fe对试验小鼠血清中ALT，AST的影响见表1。

表1 多肽-Fe对试验小鼠血清中ALT，AST的影响

由表1可知，正常组小鼠血清中ALT和AST的含量最低，食用CCl4后对小鼠肝脏造成了一定的损伤，但给药组的ALT和AST显著低于模型组，说明酶法制备的多肽-Fe对由自由基造成的肝损伤有一定预防作用，作用的机制可能是多肽-Fe在动物体内有抗氧化、消除自由基的作用。

2.3 多肽-Fe对小鼠肝脏中GSH-Px，SOD，MDA的影响

多肽-Fe对小鼠肝脏中GSH-Px，SOD，MDA的影响见表2。

由表2可知，分析小鼠肝脏中GSH-Px活力变化，可以看出给药组肝脏中GSH-Px的活性接近正常组，高于模型组。模型组小鼠GSH-Px活性比较低，说明CCl4能破坏肝脏的氧化-抗氧化平衡，增加自由基的累积，降低GSH-Px的活性。测定小鼠肝匀浆中SOD活性，结果显示模型组的SOD含量较其他组明显升高（p＜0.05），给药组SOD含量略高于正常组。这可能与肝脏受到损伤后SOD代偿性升高有关，在CCl4灌胃后给药组小鼠肝脏有损伤，但因长期灌服多肽-Fe，还是起到了一定的保护作用。模型组的MDA含量显著高于其他2组，说明CCl4对小鼠的肝脏细胞造成了较大损害。给药组小鼠肝匀浆中MDA的含量显著低于模型组小鼠，但略高于正常组MDA水平。表明多肽-Fe具有一定的降低细胞脂质过氧化的能力。

表2 多肽-Fe对小鼠肝脏中GSH-Px，SOD，MDA的影响

2.4 小鼠肝脏HE染色结果

小鼠肝脏HE染色结果（200倍）见图2。

图2 小鼠肝脏HE染色结果（200倍）

由图2可知，图2（a）中小鼠肝脏组织结构完整、肝细胞分界清晰，以中央静脉为中心向四周呈放射状整齐排列，核位于细胞中央，核圆而清晰，胞质丰富，说明正常组小鼠肝脏无病理异常。图2（b）中小鼠肝脏组织结构消失，肝细胞索紊乱，大部分肝窦消失，说明模型组小鼠肝脏出现明显的病理异常。图2（c）中，给药组小鼠肝细胞较有序地排列在中央静脉周围，肝细胞形态、排列均好于模型组，说明多肽-Fe对CCl4诱导小鼠肝损伤有一定的保护、缓解效果。

3 结论

通过CCl4急性肝损伤试验，证明多肽-Fe对急性肝损伤有一定的预防作用，多肽-Fe能降低由于肝损伤造成的血清中AST，ALT活力，提高肝脏中GSH-Px活力，较好地抑制小鼠肝组织中MDA的形成及肝损伤后SOD代偿性升高，为酶法制备多肽-Fe提供一定的理论基础。HE染色结果表明，多肽-Fe可在一定程度上改善CCL4造成的肝损伤。为酶法制备多肽-Fe提供了一定的理论支持，为我国猪血资源的开发提供理论基础。

［1］ 梅书棋.建设美丽猪场，推进猪业升级 ［J］.猪业观察，2015（3）：24-26.

［2］ 王洪江，谢跻，柳婷，等.猪血的综合开发与应用研究进展 ［J］.肉类研究，2009（12）：81-87.

［3］ 张华山.猪血蛋白的酶水解及氨基酸含量 ［J］.氨基酸和生物资源，1999（3）：35-37.

［4］ 汤定明.休闲猪血肉糕的研制 ［J］.肉类工业，2014（12）：1-4.

［5］Omaye S T，Tappel A L.Effect of dietary selenium onglutathione peroxidase in the chick［J］.Journal of Nutrition，1974，104（6）：747-753.

［6］ 韩宏星，曾慧慧，屠鹏飞，等.迷迭香总二萜酚的体内抗氧化作用研究 ［J］.中草药，2003（2）：147-149.

［7］ 杨群，胥维勇，何娟，等.不同固定液冷冻切片HE染色质量的对比观察 ［J］.实用医院临床杂志，2010，7（3）：69-70.◇

Studies on Antioxidant Effect in Vivo of Polypeptide-Fe from Hemoglobin by Enzymatic Hydrolysis

KONG Yu，HAN Ran，WANG Ruhua，CHEN Wen，*LIU Changjin
（College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

To study the antioxidant effect in vivo of Polypeptide-Fe from Hemoglobin by enzymatic hydrolysis on mice.Contents of alanine transaminase（ALT）and aspartate transaminase（AST）in serum，and enzyme activities ofglutathione peroxidase（GSH-Px）and superoxide dismutase（SOD）and malondiadehyde（MDA）and protein in liver are measured.The followings are results.Polypeptide-Fe can reduce the contents of ALT and AST which will rise after the liver damage，can inhibit thegSH-Px activity decrease，can significantly inhibit the formation of MDA in liver and the activities of SOD compensatorily increased in liver.HE dyed results show that Polypeptide-Fe has a certain improvement on liver injury.

pig blood hemoglobin；Polypeptide-Fe；antioxidant effect

TS251.93

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.04.006

1671-9646（2016）04a-0020-03

2016-01-24

孔 宇（1986— ），男，硕士，助理工程师，研究方向为粮油加工。

*通讯作者：刘常金（1969— ），男，博士，副教授，研究方向为农产品加工及贮藏工程。