刘豨逍遥五苓汤对肝纤维化大鼠病理组织学及超微结构的影响*

姜一鸣 姜学连刘新军 孙 建 王慧凯 路玉良 宋荣强 魏 铭

（滨州医学院附属医院，山东 滨州 256600）

·研究报告·

刘豨逍遥五苓汤对肝纤维化大鼠病理组织学及超微结构的影响*

姜一鸣 姜学连△刘新军 孙 建 王慧凯 路玉良 宋荣强 魏 铭

（滨州医学院附属医院，山东 滨州 256600）

目的 观察刘豨逍遥五苓汤对肝纤维化大鼠的组织学及超微结构变化的影响。方法 用腹腔注射猪血清法制作免疫性大鼠肝纤维化模型，用刘豨逍遥五苓汤进行预防和治疗，并与秋水仙碱对照，用光镜观察肝脏组织学染色（HE染色）、Masson三色胶原纤维染色的变化，用电镜观察肝脏组织超微结构的变化。结果 中药治疗组肝脏HE染色、Masson染色及超微结构的改善情况明显优于西药对照组（P＜0.01）。结论 刘豨逍遥五苓汤能够保护肝细胞，减轻肝细胞变性、坏死，抑制贮脂细胞的活化和增殖，减少胶原纤维的成和分泌，阻抑肝纤维化发展。

刘豨逍遥五苓汤 肝纤维化 组织学 超微结构

慢性乙型肝炎为临床疑难病，病情反复发作，其中大部分合并肝纤维化，甚至进一步发展为肝硬化、肝癌。本病属中医学“胁痛”“黄疸”“积聚”“臌胀”等范畴。近十余年来，我们应用国医大师朱良春的刘豨逍遥五苓汤治疗慢性肝炎取得良好效果［1-2］。在此基础上，笔者将该方对猪血清注射法复制的大鼠肝纤维化模型的治疗作用进行了实验研究，用光镜、电镜观察了纤维化大鼠的肝脏组织学及超微结构的变化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用Wistar大鼠98只 ［购于山东大学医学院实验动物中心，动物许可证号SYXK（鲁）20130019］。全部为雄性，清洁级标准，体质量95～105 g。大鼠的饲养温度控制在20～25℃，湿度应控制在40%～70%，饮用凉开水。

1.2 试药与仪器 Masson三色染色试剂盒:福州迈新生物技术公司，即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒、层粘蛋白（LN）、纤维粘蛋白（FN）检测试剂盒均购于北京中山生物技术公司。苏木素:美国sigma公司。伊红:美国sigma公司。甲醛:广州化学试剂厂。戊二醛:广州化学试剂厂。秋水仙碱:广东彼迪药业有限公司。JEM-120EXDJD型透射电镜:日本电子株式会社，高清晰彩色病理图文分析系统:法国VL公司。光学显微镜:西德OPTN-Ⅲ。刘豨逍遥五苓汤，组方:刘寄奴20 g，豨莶草30 g，柴胡12 g，赤芍30 g，郁金12 g，当归10 g，丹参30 g，莪术12 g，苍术12 g，土茯苓30 g，茵陈15 g［3］。中药购于广东一方制药有限公司。

1.3 分组与造模 98只大鼠正常状态下喂养1周，将所有大鼠编号，随机分为7组:每组14只。包括正常组、模型1组、模型2组、中药预防组、中药治疗组、西药预防组、西药治疗组。模型制作参照于世瀛等［4］的腹腔注射猪血清法制作肝纤维化大鼠模型。从滨州市肉联厂购买猪血，离心提取血清，保存于冰箱冷藏室中备用。正常组予0.9%氯化钠注射液0.5 mL腹腔注射，其余各组均取0.5 mL猪血清大鼠腹腔内注射，每周2次，正常组一半的大鼠、模型1组、中药预防组、西药预防组大鼠连续注射5周，其余各组连续注射10周。

1.4 给药方法 刘豨逍遥五苓汤水煎浓缩制成相当于每毫升药液含3 g生药的浓度（即300 g中药，煎取100 mL药液）。中药预防组、西药预防组及模型1组于造模同时开始给药。中药预防组按3 g生药/100 g体质量予刘豨逍遥五苓汤灌胃，西药预防组按0.02 mg/ 100 g体质量予秋水仙碱灌胃，模型1组给以等量自来水灌胃，均连续35 d。中药治疗组、西药治疗组及模型2组于造模第36日开始分别给予刘豨逍遥五苓汤、秋水仙碱及自来水灌胃，剂量、方式、时间同前。

1.5 标本采集与检测［5］1）光镜观察肝脏组织结构的变化、胶原纤维增生情况及肝组织超微结构变化:第一次取材，造模35 d后，正常组一半，模型1组，中药预防组和西药预防组大鼠分别断头处死，剖开腹腔，暴露肝脏，切取距边缘3 mm处肝组织，体积约0.5 cm× 0.5 cm×0.5 cm，用10%的中性甲醛固定24 h，酒精逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚约5 μm，脱蜡到水，HE染色。采用免疫组织化学SABC法检测LN、FN，光镜观察肝脏组织结构的变化及胶原纤维增生情况。另外取体积约1 mm×1 mm×2 mm的肝组织，用2.5%戊二醛前固定2～4 h，1%锇酸后固定1.5 h；用丙酮逐级脱水，812树脂包埋，电镜切片厚度约60 nm，用醋酸双氧铀-枸橼酸铅双重染色，然后用JEM-120EXDJD型透射电镜观察肝组织的超微结构的变化［6］。造模70 d后，正常组剩余大鼠，模型2组，中药治疗组和西药治疗组取材处理、染色、观察方法与第一次取材相同。2）各组胶原含量比较:病理组织切片Masson三色胶原染色［7］，胶原阳性着色呈红色，肝脏背景为淡黄色，用图像分析仪处理，测量均用低倍镜（16×12），随机选择6个汇管区进行染色胶原的定量分析，测量数据取均值。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，组间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况 本研究应用腹腔注射猪血清法制作肝纤维化大鼠模型，基本不影响大鼠体质量增长，大鼠毛发光泽，一般活动状态良好，体质量变化不大，各组动物之间外观无明显差异［8］。共有5只大鼠在灌胃时不慎呛死:模型1组、西药预防组、西药治疗组各1只，模型2组2只。

2.2 各组大鼠肝脏组织结构的变化及胶原纤维增生情况 见图1，图2。1）肝组织结构变化。正常组肝小叶间没有明显的纤维间隔，肝细胞排列整齐，结构清晰，无肝细胞变性、坏死。模型2组肝组织内纤维组织增生比较明显，有些部位形成纤维间隔，正常的肝脏小叶结构被改建，形成典型的假小叶，有不少肝细胞肿胀变性、坏死、细胞质变得空泡状，伴有炎性细胞浸润，说明动物肝纤维化模型制作成功。中药治疗组肝脏的组织结构接近正常，汇管区纤维组织增生比较少，没有形成明显的纤维间隔，肝细胞变性较轻。中药预防组肝组织结构基本正常，纤维组织增生不明显；西药治疗组纤维间隔形成，分割肝小叶，但纤维组织增生的程度轻于模型组，有部分变性、坏死的肝细胞及炎性细胞浸润。西药预防组纤维组织增生比较明显，但比模型组的纤维间隔量少且相对细一些，小叶结构基本完整。2）肝组织胶原纤维增生情况Masson三色胶原染色，胶原阳性着色呈红色，肝脏背景为淡黄色，正常组胶原纤维含量较少，模型组有大量胶原纤维增生，中药治疗组胶原纤维增生较少。

图1 各组大鼠肝脏组织结构变化（HE染色，200倍）

图2 各组大鼠胶原纤维增生情况（Masson三色胶原染色，100倍）

2.3 各组大鼠肝组织中LN、FN分布情况 见图3，图4。正常组LN在肝脏内主要分布于基膜，在汇管区分布于血管和胆管以及中央静脉周围，并且沿肝窦周隙的外侧均匀排布。模型2组LN增生比较明显，在基膜和纤维间隔中分布，在血管壁上也可以见到LN分布，中药治疗组和中药预防组LN的增生明显轻于模型组，西药治疗组和西药预防组LN有明显的增加。正常组FN主要分布于肝血窦壁内侧以及汇管区的间质中。模型组FN增生的量比较大，在纤维间隔及汇管区比较明显，有许多FN阳性细胞分布于间质中，FN也分布于在肝窦壁外侧。

图3 各组大鼠肝组织LN分布情况（SABC染色，200倍）

图4 各组大鼠肝组织FN分布情况（SABC染色，200倍）

2.4 各组胶原、LN、FN含量比较 见表1。各组胶原、LN、FN含量比较，模型组与正常组相比有显著差异（P＜0.01），中药治疗组与西药治疗组相比差异明显（P＜0.01）。

表1 各组大鼠胶原、LN、FN含量比较（±s）

表1 各组大鼠胶原、LN、FN含量比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与西药治疗组比较，△△P＜0.01。

组别 n FN（MOD）正常组 14 28.76±4.89模型组 25 327.23±46.65**中药预防组 14 33.31±6.87##胶原 LN（MOD）24.35±6.57 34.58±4.95 185.64±30.56**317.24±39.45**30.25±6.31##39.85±6.25##中药治疗组 14 37.24±9.75*△△36.58±8.29*△△40.51±6.87*△△西药预防组 13 47.06±9.32**##72.32±22.81**##110.23±17.74**##西药治疗组 13 100.93±23.81**##191.35±34.63**##176.97±29.38**##

2.5 电镜下超微结构观察 见图5。正常组大鼠肝脏超薄组织切片在透射电镜下观察，线粒体分布比较均匀，呈现为椭圆形或圆形或，粗面内质网比较多，呈现平行排列，滑面内质网相对比较少，细胞核大并且比较圆，可以见到细胞核仁较多，部分细胞有双核。模型组肝细胞变性、坏死比较多，细胞之间的缝隙相对变宽，线粒体不规则变形，表现为肿胀、有一部分线粒体的嵴变窄变细、甚至消失，粗面内质网减少相对比较明显、结构出现扩张、部分颗粒脱失，滑面内质网增生比较明显，糖原颗粒与正常组相比有所减少，有些核仁消失，细胞核固缩，内皮细胞之间窗孔出现基膜样物质，并且逐渐封闭，肝窦壁变成连续性，肝窦逐渐变成毛细血管化，有大量纤维束分布于肝窦内，呈现交织排列，贮脂细胞外形增大，细胞质内细胞器增多而脂滴减少，逐渐转变为成纤维细胞。中药治疗组大鼠肝脏窦周隙胶原纤维增生比较少，肝细胞内粗面内质网比较多，线粒体相对比较丰富，糖原颗粒增多比较明显，肝细胞变性比较少见。中药预防组肝细胞结构基本正常。西药治疗组肝细胞内线粒体、粗面内质网、糖原颗粒与中药组比较减少明显，胶原纤维束出现于汇管区及窦周隙有，表现为肝窦毛细血管化，肝细胞变形比较多见，成纤维细胞、贮脂细胞增加比较明显。西药预防组大鼠肝脏组织结构基本正常，肝窦周隙胶原纤维束相对比较少。

图5 各组大鼠超微结构观察

3 讨 论

各种原因引起的慢性肝病都具有炎症、坏死和纤维化的病理特征。肝脏纤维组织增生是慢性肝炎、肝硬化的基本病理改变之一［9］，治疗慢性肝炎肝纤维化，中医药以活血化瘀、疏肝利胆、补气健脾等法为主治疗该病，有比较明显的疗效，并且积累了丰富的经验。

朱良春先生为首届国医大师，在肝病治疗方面有独到的经验，朱老认为肝郁脾湿久结不解，肝胆疏泄失常，至黄疸日久不退，多瘀阻肝胆，宜解郁疏肝、以通络和营［3］。其用茵陈五苓散配合局方逍遥散加减，创立刘豨逍遥五苓汤，用以治疗慢性肝病取得良好效果。方中刘寄奴配合豨莶草，一温一寒，寒温相佐，其配伍可热可寒，可气可血，可降酶退黄，可活血解毒，可化瘀平肝，可散结消瘕，更有统治肝性黄疸之功［10］，为方中之主药，为该方之特色配伍。柴胡、郁金解郁疏肝；苍术、土茯苓健脾祛湿；茵陈、泽泻清肝利胆退黄；赤芍、丹参、莪术、当归活血养血［11-12］；生麦芽消食和胃、且有利胆退黄之用，全方配伍得当，切中病机，故能取得很好的治疗效果。现代药理研究证明，刘寄奴浓缩煎液可使醋酸棉酚引起的大鼠高血清谷丙转氨酶明显下降，对麻醉犬和大鼠有明显利胆作用。刘寄奴总生物碱和总黄酮均能防治醋酸棉酚肝损害引起的大鼠高谷丙转氨酶谷丙转氨酶［13］。朱老善用豨莶草治疗黄疽型肝炎，认为此证多系湿热抟于血分所致，若迁延时日，瘀热胶结难解，一般利湿退黄之剂，殊难中的，必须凉血活血，解毒护肝始为合拍，凡黄疽缠绵不退，湿热疫毒稽留，朱老每从血分取法，以豨莶草配合丹参、刘寄奴等，多能应验［14］。柴胡皂苷能使半乳糖所致的肝功能与组织损伤恢复，对四氯化碳引起的小鼠肝损伤实验，可见过氧化质含量降低，肝脏中谷胱甘肽含量升高，而血清中谷丙转氨酶含量下降［15］；丹参可明显减轻肝坏死和炎症反应，经丹参治疗的肝纤维化动物，肝纤维化较对照组明显减轻。大量文献报道:赤芍、郁金、当归、茵陈、白术、茯苓等药有促进肝细胞修复，降低转氨酶，减轻肝脏胶原纤维增生的作用。

用猪血清腹腔注射法复制大鼠肝纤维化动物模型，该模型与其他模型比较，具有周期短、经济、方法简单、整体损伤轻、肝纤维化出现率高等特点［3］。本实验中药预防组大鼠的肝脏组织结构接近正常，血液循环没有改建，纤维组织增生不明显，肝细胞变性、坏死比较轻微；中药治疗组肝细胞变性坏死与西药组相比明显减少，纤维组织增生相对比较轻，贮脂细胞、成纤维细胞比西药组明显减少。秋水仙碱治疗肝纤维化也有一定的作用，但西药治疗组大鼠肝脏组织内胶原纤维的含量与中药治疗组相比明显增多。Masson三色胶原染色，经图像分析仪做半定量分析处理后，模型组肝组织内胶原纤维的含量是正常组的7.59倍，西药治疗组是正常组的4.14倍，中药治疗组是正常组的1.5倍，中药治疗组与西药治疗组相比，疗效明显，两组有非常显著性差异。肝组织内非胶原糖蛋白主要有FN及LN，肝纤维化时FN作用于肝细胞，使之分泌胶原，并且也可以使成纤维细胞、肝窦内皮细胞增生，分泌细胞外基质，使纤维化继续发展。LN是基底膜的主要组成成分，肝纤维化时其形成增加，其含量增加与肝窦毛细血管化，也就是与肝纤维化的不可逆性有关［5］，模型组FN和LN明显增多，中药治疗组，FN与LN的增生相对比较少，中药治疗组与西药治疗组比较有显著差异。本实验结果表明:刘豨逍遥五苓汤能够保护肝细胞，减轻致病因素引起的肝细胞变性和坏死，促进肝细胞结构及功能的恢复；能够抑制贮脂细胞向成纤维细胞的转化及增殖，减轻纤维组织及非胶原糖蛋白的合成以及分泌，促使肝纤维化进展减慢或者逆转。

［1］ 姜一鸣，姜学连，刘新军，等.中医综合治疗慢性乙型肝炎肝纤维化优化方案的研究［J］.世界中西医结合杂志，2015，10（1）:75-77.

［2］ 姜学连，张国栋，孙云廷，等.刘豨逍遥五苓汤治疗慢性重度肝内淤胆型肝炎的临床研究［J］.中国中医急症，2008，17（9）:1217-1218.

［3］ 邱志济，朱建华，马璇卿，著.朱良春杂病廉验特色发挥［M］.北京:中医古籍出版社，2004:211-212.

［4］ 于世瀛，贲长恩，杨美娟，等.免疫性和化学性损伤肝纤维化动物模型的比较研究［J］.实验动物科学与管理，1995，12（4）:5-12.

［5］ 姜学连，靳艳华，贲长恩.中药2号方抗大鼠肝纤维化的组织化学及免疫组织化学实验研究［J］.中国中医基础医学杂志，2002，8（11）:48-50.

［6］ 姜学连，崔银枝，靳艳华.慢肝合剂抗肝纤维化的形态学实验研究［J］.滨州医学院学报，2003，26（6）:434-436.

［7］ 姜学连，贲长恩，于世赢.中药2号方抗肝纤维化的形态学和血清学实验研究［J］.北京中医药大学学报，1999，22（3）: 36-37.

［8］ 袭柱婷，单长民，姜学连，等.三棱莪术抗大鼠免疫性肝纤维化的研究［J］.中国中药杂志，2002，27（12）:929-931.

［9］ 刘新军，姜学连.中医药治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床研究进展［J］.滨州医学院学报，2013，36（6）:437-439.

［10］刘新军，王慧凯，姜学连.刘豨汤抗大鼠肝纤维化作用机制的实验研究［J］.中国中医急症，2015，24（12）:2141-2143.

［11］姜学连，孙云廷，魏铭.加味黄精汤治疗慢性乙型肝炎的临床研究［J］.中华中医药学刊，2009，27（8）:1611-1612.

［12］姜学连，刘新军.《内经》有关水气病的论述对治疗肝硬化腹水的指导意义［J］.辽宁中医药大学学报，2010，12（8）: 7-8.

［13］孙文忠，潘颖宜，郭忻，等.南北刘寄奴活血化瘀药理作用的比较研究［J］.成都中医药大学学报，1997，20（3）:51-53.

［14］王发辉，冯起校，黄超文.豨莶草药理研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2011，13（10）:102-104.

［15］沈霞，张岗，陈莹.柴胡防治乙型肝炎的网络分子机理初探［J］.陕西中医，2015，36（1）:113-114.

Effect of Liuxi Xiaoyao Wuling Decoction on Histopathology and Ultrastructure of Hepatic Fibrosisin Rats

JIANG Yiming，JIANG Xuelian，LIU Xinjun，et al.Affiliated Hospital of Binzhou Medical College，Shandong，Binzhou 256600，China.

Objective:To observe the changes of histopathology and ultrastructure of Liuxi Xiaoyao Wuling Decoction on hepatic fibrosis in rats.Methods:The immunohepatic fibrosis model was induced by intraperitoneal injection of porcine serum，and treated and prevented with Liuxi Xiaoyao Wuling Decoction，and compared with colchicine.The changes of HE and Masson of the rats′liver were observed with optic microscope；the ultrastructure was observed with electronic microscope.Results:The improvement of HE staining，Masson staining and ultrastructure of the treatment group was superior to that of the control group obviously（P＜0.01）.Conclusion:Liuxi Xiaoyao Wuling Decoction can protect liver cells，reduce liver cell degeneration and necrosis，inhibit fat storing cell′s activation and proliferation，reduce collagen fiber formation and secretion，and inhibit the development of liver fibrosis.

Liuxi Xiaoyao Wuling Decoction；Liver fibrosis；Histology；Ultrastructure

R285.5

A

1004-745X（2016）10-1877-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.013

山东省中医药科技发展计划（2009-185）

△（电子邮箱：bzjxl@163.com）

（2016-05-08）