江西烟区烟草黑胫病菌生理小种研究初报

张超群，周泽科，陈荣华，张根平，蒋军喜

1 江西省烟叶科学研究所，南昌 330025；2 江西农业大学农学院，南昌 330045；3 赣州市烟草科学研究所，赣州 341008；4 江西省瑞金市烟草分公司，瑞金 342500

江西烟区烟草黑胫病菌生理小种研究初报

张超群1，周泽科2，陈荣华3，张根平4，蒋军喜2

1 江西省烟叶科学研究所，南昌 330025；2 江西农业大学农学院，南昌 330045；3 赣州市烟草科学研究所，赣州 341008；4 江西省瑞金市烟草分公司，瑞金 342500

为进一步明确江西烟区烟草黑胫病菌的生理小种及其分布，在江西省主要烟区采集烟草黑胫病病株样品80个，从中分离纯化出28个烟草黑胫病菌株。采用游动孢子悬浮液灌根接种鉴别寄主和TTZ培养基颜色反应两种方法鉴定其生理小种类型。结果表明，28个菌株对烟草品种L8具有较强的致病力，对N.nesophila无致病力，在TTZ培养基中皆呈现红色反应，表明其皆为1号生理小种。推测江西烟区烟草黑胫病为害病原菌主要为烟草黑胫病菌1号生理小种。

江西；烟草黑胫病菌；生理小种

烟草黑胫病是一种分布广泛、为害严重的世界性烟草主要病害。1896年首次发现于印度尼西亚的爪哇，此后迅速蔓延全世界[1]。20世纪60年代以来，美国、南非、印度、中国等主要产烟国对烟草黑胫病菌致病性及生理生化进行了研究[2]。迄今为止，国内外已发现0号、1号、2号、3号共4个烟草黑胫病生理小种[3-5]。朱贤朝等[6]在20世纪80年代对我国烟草黑胫病菌生理小种的研究发现，我国存在0号和1号生理小种及一个未鉴定出生理小种的致病型。种植抗病品种是防治此病最为有效的措施，在使用抗病品种时, 烟草黑胫病菌致病性发生变异的可能性是需要考虑的重要问题。在烟草种植历史上,曾发生过因高毒力菌系或新小种出现而使一些抗病品种丧失对该病的抗性。如烤烟品种NC1071和白肋烟品系L8对烟草黑胫病菌0号小种是高度抗病的,但由于1号小种的出现而使该品种儿乎丧失使用价值[6]。

近年来，由于植烟品种结构单一、栽培方式改变、长期施用单一药剂防治等原因，造成烟草黑胫病菌生理小种种群结构和种群数量的变化，使部分烤烟品种的抗病性发生改变、病原菌抗药性增加[7-10]，烟草黑胫病发生日趋严重，对烟叶产量和质量造成严重损失。江西省是我国的主要烟区之一，有关烟草黑胫病菌的生理分化虽有涉及，但未见系统研究报道。因此，研究江西烟区烟草黑胫病菌的生理小种及其分布，有助于为江西烤烟品种的合理布局和黑胫病的综合防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

2011—2013年，于江西省主要产烟区采集具有典型症状的烟草黑胫病病株样品80个，分离纯化得到烟草黑胫病菌菌株28个。

1.2 病原菌分离

取典型的烟草黑胫病病株茎秆，用自来水洗净后，于超净工作台内用70%酒精擦拭茎杆后烧去残留酒精，用消毒刀片从病健交接处切去茎杆表皮，切取5 mm × 5 mm大小的木质部小块组织6块，转移燕麦培养基上，将平板置于30℃恒温培养箱中培养，待菌落长至合适大小后，从菌落边缘挑取少量菌丝块于燕麦培养基上进行纯化，再从纯化的菌落中挑取少量菌丝块转接于燕麦培养基斜面，30℃培养5 d后，加入已灭菌矿物油以保存菌种。矿物油的加入量为超过斜面1cm。

1.3 供试培养基

燕麦培养基[11]：燕麦片30 g，琼脂18～20 g；燕麦片加入至1000 mL水中，加热煮沸15～20 min，纱布过滤后加熔化好的琼脂，水补足1000 mL，分装灭菌 (121℃，20 min)。

TTZ固体培养基：高压灭菌燕麦培养基冷却至约45℃后，加入经0.22 μm滤器除菌的0.05%(W/V)TTZ（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）。

TTZ液体培养基[12]：蔗糖30 g，柠檬酸20 g，CaCl21.0g，KNO32.0g，KH2PO40.67g，K2HPO40.33g，1% FeCl310滴，VB1 1 mg；加水补足至1 L，pH 5.5，121 ℃蒸汽灭菌30 min后，冷却至约45℃后加入经0.22 μm滤器除菌的0.05%(W/V) TTZ。

1.4 烟草黑胫病菌生理小种鉴定

1.4.1 TTZ培养基颜色反应鉴定

根据烟草黑胫病菌在TTZ培养基中菌体颜色变化，对烟草黑胫病菌生理小种进行鉴定。0号和1号生理小种在TTZ固体培养基和TTZ液体培养基中菌体由白色变为浅红色，而3号生理小种菌体颜色无变化。

(1) 在TTZ固体培养基上颜色变化

挑取各菌株菌落边缘菌丝体接种到含TTZ固体培养基上，另接菌块于不含TTZ的培养基上作为对照，于25 ℃恒温培养箱中培养，48 h后观察菌体颜色变化。

(2) 在TTZ液体培养基上颜色变化

挑取各菌株菌落边缘菌丝体接种到TTZ液体培养基中，另接菌块于不含TTZ的普通培养液中作为对照。于25 ℃恒温培养箱培养，72 h后观察菌体颜色变化。

1.4.2 鉴别寄主鉴定

参照李振岐[13]鉴别寄主选择标准和李斌[14]、刘廷利等[15]的方法，选择NC1071、N. nesophila、L8和小黄金1025作为鉴别寄主，种子均为中国农业科学院烟草研究所提供。

采用伤根灌注法对鉴别寄主进行接种。先用少量无菌水湿润培养土，再用灭菌镊子深插烟株周围以达到伤根效果；用浓度为1×104cfu/mL的游动孢子悬浮液灌根接种6～8叶期烟株，每株灌注10 mL悬浮液，每处理3株，并设置3个重复，另设清水接种作为对照；将接种烟株置于28 ℃光照培养箱内光照培养，9 d后参照Jaarsveld[16]的烟草黑胫病病害分级标准统计接种鉴别寄主的发病情况。各菌株在鉴别寄主上的反应见表1。

表1 鉴别寄主对不同生理小种烟草黑胫病菌的反应Tab.1 Reaction of differential hosts to different races of P.parasitica var. nicotianae

烟草黑胫病病害分级标准：

0级：全株无病。

1级：茎部病斑不超过茎围的1/3，或1/3以下叶片凋萎。

3级：茎部病斑环绕茎围的1/3至1/2，或1/3至1/2叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑。

5级：茎部病斑超过茎围的1/2，但未全部环绕茎围，或1/2至2/3叶片凋萎。

7级：茎部病斑全部环绕茎围，或2/3以上叶片凋萎。

9级：病株基本枯死。

2 结果与分析

28个菌株接种于TTZ固体培养基24 h后，菌丝体开始出现颜色变化，呈淡红色；48 h后红色范围进一步扩大，菌丝体颜色进一步加深至红色。28个菌株接种于TTZ液体培养基60 h后，菌丝体颜色呈浅红色；72 h后菌丝体依旧为浅红色，颜色未出现进一步加深变化(见图1)。根据显色反应可初步确定，28个供试菌株为生理小种0号或1号，而非生理小种3号。

图1 部分烟草黑胫病菌株在TTZ培养基上颜色反应Fig. 1 Color reaction of spme Phytophthora parasitica var. on TTZ medium nicotianae

表2可知：L8、小黄金1025的病情指数均在75以上，表现为感病；N. nesophila的病情指数均在25以下，表现为抗病。根据各鉴别寄主发病结果，28个供试菌株均属生理小种1号，未发现0号生理小种存在。

表2 各供试菌株接种不同鉴别寄主发病病情指数统计结果Tab. 2 Disease index statistic of differential hosts inoculated with the tested strains

3 小结与讨论

28个菌株在TTZ固体和液体培养基上均能显红色，在TTZ固体培养基上显示更快且颜色变化更明显，初步确定了供试菌株为0号或1号生理小种。TTZ是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，当其进入菌体后，可作为氢受体被菌体内脱氢辅酶上的氢还原，而由无色变为不溶于水的稳定的红色三苯甲腙。经TTZ染色后，菌丝内原生质浓的部位变色通常较深，可能与该部位的脱氢酶含量高、活性强有关[17]。烟草黑胫病菌0号和1号生理小种的菌体内含有能使TTZ还原的相关脱氢辅酶，而3号生理小种菌体内则不具有此类脱氢酶，因而通过TTZ显色反应可将0号、1号小种跟3号小种区分开。

L8、NC1071、N.nesophila和小黄金1025因具有鉴别能力强、反应灵敏和抗感分明等优点而成为目前国内外研究中采用相对较多的寄主组合之一。如朱贤朝[6]、李斌[14]、刘廷利[15]、李锡坤[18]等均采用该组合。本试验结果表明该组合对0号、1号和3号生理小种菌株具有很强的鉴别能力，反应明显，抗感分明。

TTZ显色反应和鉴别寄主鉴定结果表明，江西烟区烟草黑胫病菌的优势种是1号生理小种，与苗圃[5]、王智发等[17]的鉴定结果基本一致，而与朱贤朝等[6]的鉴定结果有差异，这种差异是受接种方法影响、还是受环境条件影响或鉴别寄主基因型的影响所致，还有待进一步研究。至于江西烟区是否还存在烟草黑胫病菌的其他生理小种类型，还需要进一步扩大采样范围并进行分析鉴定。同时，江西烟区在进行品种布局时应选择对烟草黑胫病菌1号生理小种抗病的烟草品种为主，但仍不能忽视烟草品种对烟草黑胫病菌0号生理小种的抗性问题。

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Preliminary report of research onPhytophthora parasiticaphysiological races in tobacco growing areas in Jiangxi province

ZHANG Chaoqun1, ZHOU Zeke2, CHEN Ronghua3, ZHANG Genping4, JIANG Junxi2
1 Jiangxi Provincial Institute of Tobacco Leaf Science , Nanchang 330025, China;2 College of Agronomy, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China;3 Ganzhou Municipal Tobacco Research Institute, Ganzhou 341008, Jiangxi, China;4 Jiangxi Ruijin Municipal Tobacco Company, Ruijin 342500, Jiangxi, China

Physiological races of 28Phytophthoraparasiticavar.nicotianaestrains were isolated from 80 samples collected in tobacco growing areas of Xinfeng, Ruijin, Guangchang and other major areas of Jiangxi province, and were identi fi ed by zoospore suspension inoculation and TTZ color reaction. Results showed that all 28 strains were highly pathogenic to tobacco cultivar L8 but not to N．nesophilaand all of them presented red reaction on TTC medium, which indicated that all strains belong to physiological race 1.

Jiangxi;Phytophthoraparasiticavar.nicotianae; physiological race

张超群，周泽科，陈荣华，等. 江西烟区烟草黑胫病菌生理小种研究初报[J]. 中国烟草学报，2016,22（4）

国家烟草专卖局重点项目（110200902065）；江西省烟草专卖局科技项目“江西省烟草有害生物调查研究”（201001021）

张超群（1982—），农艺师，硕士，主要从事烟草病虫害防治研究, Email:chaoqunyc@163.com

蒋军喜（1964—），博士，教授，主要从事植物病原鉴定及病害防治研究, Email：jxau@126.com

2014-10-20

:ZHANG Chaoqun, ZHOU Zeke, CHEN Ronghua, et al. Preliminary report of research onPhytophthoraparasiticaphysiological races in tobacco growing areas in Jiangxi province [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(4)