鼠李糖乳杆菌的筛选与诱变

鼠李糖乳杆菌的筛选与诱变

乳酸菌培养物中含有乳酸菌、多种代谢产物及变性培养基成分，可以作为一种有益的饲料添加剂。本试验的目的就是要选育出一株抑菌活性高而广，产酸性能强和生长繁殖速度快且稳定性好的乳酸菌菌种，以利于今后饲用微生态制剂的开发与应用。现将试验结果报告如下。

材料与方法

菌种

乳酸菌

嗜酸乳杆菌700株、粪链球菌48株，由本校微生物室保存；短乳杆菌（17）、嗜酸乳杆菌、粪链球菌（130）、胚乳杆菌（557）、德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种（1690），购于中国科学院微生物研究所。

指示菌

金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌（K88）、鸡白痢沙门氏菌、蜡状芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、无乳链球菌，购于中国兽医药品监测所。

乳酸菌的筛选

乳酸菌的分离与鉴定

用MRS和Elliker琼脂培养基分离鉴定。

乳酸菌的第一步筛选

用牛津杯双层平板定量扩散法（参照何宁等（1999）介绍的方法，略加改进）筛选抑菌谱广、抑菌圈直径大的乳酸菌菌种（株）。

乳酸菌的第二步筛选

将产生抑菌物质的乳酸菌接种在MRS液体培养基上，37℃培养48h后，用酸度计测定乳酸菌培养物的酸碱度。

乳酸菌的第三步筛选

测抑菌物质重量。

乳酸菌紫外线诱变与筛选

参考诸葛健等 介绍的方法，稍做改进。以乳酸菌的抑菌活性、产酸能力和稳定性为检测项目筛选正向突变菌株。

结果与分析

乳酸菌分离鉴定

根据分离菌的形态、染色及生化特性，可以初步鉴定为：L1、L2是植物乳杆菌；L3是鼠李糖乳杆菌；L4是短乳杆菌；L5是詹氏乳杆菌。

乳酸菌的筛选

将9种13株乳酸菌于4℃冰箱中保存三个月后活化，仅有五种菌活化成功，对其进行了抑菌活性、产酸能力及生长速度的测定。

鼠李糖乳杆菌L3株和胚乳杆菌（557）均有较强的抑菌活性和产酸能力，但前者生长繁殖速度快，菌体干重是胚乳杆菌的1.83倍，故认为鼠李糖乳杆菌L3株是理想的目的菌。

鼠李糖乳杆菌L3株的诱变与筛选

诱变致死率

用紫外线照射鼠李糖乳杆菌L3株37℃、48h的培养物，不同照射时间对其致死率结果不同。

诱变后筛选结果

用紫外线照射鼠李糖乳杆菌L3株15s后，选取100个MRS平板上的菌落进行培养液抑菌活性和pH值测定。其中正向突变的10株鼠李糖乳杆菌的抑菌圈直径和pH值变化结果。

诱变菌株的抑菌圈直径增加值变化较大，以L3-22株为最高，L3-50次之；而pH值下降不明显，均不超过1%。

诱变菌株的稳定性试验结果

将10株鼠李糖乳杆菌诱变株连续传6代，测定培养液的抑菌圈直径和pH值，运用EXCEL软件统计其变异系数。鼠李糖乳杆菌L3-22株抑菌圈直径变异系数小，故该菌株的稳定性较高。

讨论

乳酸菌的分离

用MRS 和Elliker琼脂培养基及厌氧培养方法，从样品中分离出4种5株乳酸菌，根据分离菌的形态、染色及生化反应特性，初步鉴定的结果是：L1、L2为植物乳杆菌；L3为鼠李糖乳杆菌；L4为短乳杆菌；L5为詹氏乳杆菌。用于分离培养的样品较多，但分离出的乳酸菌较少，可能与乳酸菌初代分离培养较困难以及严氧条件要求较高有关。

乳酸菌的筛选

本试验对9种13株乳酸菌进行了抑菌活性、抑菌范围、产酸能力及生长繁殖速度的测定，从中筛选出鼠李糖乳杆菌L3株为理想的目的菌，其对四种革兰氏阳性菌和两种革兰氏阴性菌均有较强的抑菌作用。乳酸菌素是乳酸菌在代谢过程中产生的—种多肽类物质，属于细菌素，一般对近缘的革兰氏阳性细菌有抑制作用［4，5］。本试验筛选出的鼠李糖乳杆菌L3株产生的抑菌物质（主要是乳酸菌素）对革兰氏阳性菌和阴性菌均有较强的抑菌活性，具有重要的应用价值，其作用机理和抗菌谱尚有待于进一步研究。

乳酸菌在生长繁殖过程中，可分泌以乳酸为主的酸性物质到周围环境。鼠李糖乳杆菌L3株具有很强的产酸性能，可使培养基的酸度下降到pH值3.5以下。

乳酸菌的诱变

用紫外线照射鼠李糖乳杆菌L3株进行诱变，获得10株正向突变菌株，考虑到突变菌株的抑菌活性的稳定性是主要因素，故将抑菌活性分别提高11.74%和8.92%的两株突变菌作为目的菌。诱变菌株培养物的pH值下降不明显，可能与出发菌株的产酸能力已经很高有关。

经过乳酸菌的分离鉴定、筛选、诱变和筛选的过程，从而选育出一株抑菌活性高、抑菌活性稳定、抑菌范围广、产酸能力强及生长速度快的鼠李糖乳杆菌，即鼠李糖乳杆菌L3-22株。

引理2 对任何EB估计δn=δn（R1，R2，…，Rn）的风险函数Rn（δn）有

其中E*表示对（r1，r2，…，rn）的联合分布求期望。

定理2 在平方损失函数下，有替换定数截尾试验指数分布的参数λ，如果先验分布取Gamma 分布，参数λ的估计量是渐进最优EB估计。其中

证明：由引理2及控制收敛定理知如果

由渐进最优性的定义可得估计量δn是渐进最优EB估计。因此由控制收敛定理只需证明且即可。

10.3969/j.issn.1001- 8972.2016.21.014