低剂量X线照射对破骨细胞分化及功能活性的作用机制

邓晔坤,周晓中

(苏州大学附属第二医院骨科，江苏 苏州　215004)



低剂量X线照射对破骨细胞分化及功能活性的作用机制

邓晔坤,周晓中

(苏州大学附属第二医院骨科，江苏 苏州215004)

目的：探讨低剂量X线照射(LDI)对破骨细胞的分化及功能活性的作用机制。方法：选择RAW 264.7细胞株作为破骨前体细胞，诱导构建破骨细胞模型。将破骨细胞随机分为对照组(0 cGy LDI)、照射组(10 cGy LDI)和P2X7-/-照射组(shRNA,10 cGy LDI)。采用生物发光试剂盒检测各组培养基中三磷酸腺苷(ATP)的浓度，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色评估破骨分化成熟度，实时荧光定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测破骨细胞P2X7受体、组织蛋白酶K (cathepsin K)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因mRNA的表达情况。结果： LDI显著提高了照射组和P2X7-/-照射组细胞基质中ATP的释放，照射组中ATP分泌更加显著。形态学实验提示，LDI在一定程度上提高了破骨细胞的分化和骨吸收能力。与对照组比较，照射组P2X7受体及cathepsin K mRNA表达明显升高，而P2X7-/-照射组明显降低(P<0.05)；照射组MMP-9 mRNA表达与对照组比较无显著差异(P>0.05)，而P2X7-/-照射组MMP-9 mRNA表达明显降低(P<0.05)。结论：LDI通过ATP偶联P2X7受体，从而提高破骨细胞的活性、分化及骨吸收能力。

低剂量X线照射；破骨细胞；三磷酸腺苷；P2X7受体

随着医疗技术的普及，公众及工作人员所承受的医院内照射越来越多，对电离辐射的研究也越来越重要[1]。传统认为，任何剂量的电离辐射对生物均有危害。近年来，多位学者[2-4]报道，低剂量的电离辐射与中高剂量电离辐射不同，其可诱发对生物有益的“兴奋效应”。笔者所在单位的前期研究[5-7]已证实，低剂量X线照射(low-dose X-irradiation，LDI)可增强骨折处血管新生活动及骨痂矿化能力，并可在一定程度上促进成骨细胞和破骨细胞的分化，但其作用于破骨细胞的相关机制仍有待进一步研究。

刺激或创伤可引起胞膜内外三磷酸腺苷(adenosin triphosphate，ATP)发生变化，而电离辐射作用于生物体时，同样会诱发类似的刺激[8]。ATP通过激活P2X7离子通道受体而对K+、Na+、Ca2+选择性通透，而P2X7受体能通过激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路来调控生物活动。研究[9]已证实，MAPK信号通路和胞浆内Ca2+浓度分别调控破骨细胞的分化。本研究采用LDI干预破骨细胞，分析细胞外基质ATP及ATP偶联P2X7受体的表达情况，旨在探讨P2X7受体在LDI促进破骨细胞分化过程中的分子机制。

1　材料与方法

1.1实验对象及分组

选取RAW 264.7细胞株(上海中科院生物细胞库提供)作为破骨前体细胞，根据既往研究[7]方法成功诱导获得破骨细胞，将诱导成功的稳定破骨细胞根据随机数字表法分为对照组、照射组和P2X7-/-照射组。

1.2方法

1.2.1破骨细胞的诱导选取第3代状态良好的RAW 264.7细胞，以2×104个/cm加入含有30 ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)和50 ng/mL的核因子kappa-B受体活化因子配体(receptor activator of NF-KB ligand，RANKL)的培养基中，诱导分化4～6 d[7]。

1.2.2P2X7-/-沉默模型的建立破骨细胞诱导后第6天，加入P2X7特异性shRNA[10]，静置24 h，沉默效率>50%。

1.2.3照射条件美国Siemens公司直线加速器，X线照射，剂量率为2 Gy/min，总剂量为10 cGy，均为单次照射。

1.2.4各组破骨细胞胞外上清液中ATP释放情况检测成功诱导破骨细胞后6 d，更换各组细胞培养基，加入ATP酶抑制剂和ARL67156，培养30 min。照射组、P2X7-/-照射组给予LDI干预，静置30 min后，使用ATP生物发光试剂盒(美国Sigma公司)检测各组胞外上清液中ATP浓度。按照试剂盒说明书加样，使用Luminometer模式检测样品发光。

1.2.5抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)检测[11]使用TRAP试剂盒(美国Sigma公司)检测各组破骨细胞的分化效率，成功诱导破骨细胞后4 d，LDI干预，并静置24 h。按照试剂盒说明书漂洗并固定细胞，加入TRAP染液，37 ℃避光孵育1 h，苏木素复染2 min，采用倒置相差显微镜观察破骨细胞TRAP阳性细胞(≥3个细胞核的不规则细胞)。

1.2.6实时荧光定量逆转录多聚酶链反应(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测各组破骨细胞中P2X7受体、组织蛋白酶K(cathepsin K)及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)基因mRNA的表达情况 成功诱导破骨细胞后6 d，LDI干预后静置24 h。按Trizol法提取各组总RNA，合成cDNA，按照说明书进行PCR体系反应，并用Roche LightCycler® 480II自带的软件分析数据。引物由Invitrogen公司设计合成，引物序列见表1。

表1小鼠破骨细胞P2X7受体、cathepsin K、MMP-9和β-actin的引物序列

基因正向序列(5’-3’)反向序列(5’-3’)β-actinGACGGGGTCACCCACACTGTAGGAGCAATGATCTTGATCTTCP2X7受体TGCAGCTGGAACGATGTCTTGCGCTGGTACAGCTTATCGCTCACathepsinKCTGAAGATGCTTTCCCATATGT-GGGGCAGGCGTTGTTCTTATTCCGAGCMMP-9CGAGTGGACGCGACCGTAGTT-GGCAGGCTTAGAGCCACGACCATACAG

1.3统计学分析

2　结果

2.1LDI干预后30min各组细胞外上清液中ATP分泌比较

使用ATP生物发光试剂盒检测各组破骨细胞在LDI干预后30min上清液中ATP的分泌情况，结果显示：照射组(214.1±41.7)及P2X7-/-照射组(161.4±45.1)ATP分泌较对照组(37.3±11.2)明显增多，其中照射组增加最为显著(P<0.01)。见图1。

2.2各组破骨细胞分化效率比较

倒置相差显微镜下可见，对照组和照射组生成的TRAP阳性细胞(细胞核≥3个)较多，P2X7-/-照射组生成的TRAP阳性细胞较少，其中照射组破骨细胞成熟度最高。见图2。

2.3各组破骨细胞中P2X7受体、cathepsinK及MMP-9基因mRNA表达比较

与对照组(4.8±0.97；5.5±1.54)比较，照射组P2X7受体(15.9±2.21)及cathepsinK(13.1±1.87)mRNA表达明显升高(P<0.01)，而P2X7-/-照射组(3.2±1.01；4.1±0.83)则降低；照射组MMP-9(17.1±2.05)mRNA表达与对照组(16.5±2.30) 比较无显著差异(P>0.05,P=0.172)，而P2X7-/-照射组MMP-9(5.2±1.35)mRNA表达明显降低(P<0.01)。见图3。

3　讨论

前期研究[6-7]已证实，低剂量射线照射可促进破骨细胞的分化与成熟，与张忠新等[2]、刘树铮[3]的报道相似。作为一种能量较低的电离辐射，低剂量X射线具有机械刺激的特性。本实验进一步证实，低剂量射线照射通过促进细胞释放ATP，而使胞外ATP浓度增加，同时胞浆中的ATP可激活P2X7受体，进一步促进ATP释放(图1)。

P2X7受体是P2X嘌呤能受体家族的一个亚型，是一种非选择性配体门控离子通道，可介导细胞间的快速信息传递，广泛调控许多生理机能，包括细胞增殖与分化、功能的获得与丧失以及细胞凋亡等[12]。张秀军等[13]发现，外周单核细胞和破骨细胞中存在P2X7受体表达。Ohlendorff等[14]认为，P2X7受体可诱导破骨细胞和成骨细胞的凋亡；当P2X7受体存在缺陷时，骨折风险将增加。也有学者[15]报道，P2X7受体可激活MAPK信号通路和激活T细胞核因子(nuclearfactoractivatedTcell，NFAT)信号通路，从而促进破骨细胞的分化。本实验发现，照射组的破骨细胞分化成熟度较对照组和P2X7-/-照射组明显增高，而P2X7-/-照射组的破骨细胞分化极少，说明低剂量射线照射可能通过介导P2X7受体来调控破骨细胞的分化和成熟。P2X7-/-照射组cathepsinK及MMP-9基因mRNA表达较对照组明显减少，从另一方面说明了P2X7受体对低剂量射线促进破骨细胞分化及骨吸收的介导作用。此外，照射组中P2X7受体mRNA表达明显多于对照组，进一步说明低剂量射线照射能促进细胞释放ATP，激活P2X7受体。

在成骨细胞增殖分化中，低剂量射线照射能激活PI3K/Akt信号通路，并级联激活MAPK/细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedproteinkinase，ERK)蛋白，进一步激活下游核因子kappa-B(nuclearfactorkappa-B，NF-КB)、糖原合成酶激酶(glycogensynthasekinase3，GSK3)及Runx2等蛋白，从而调控成骨分化过程，初步证实了低剂量射线照射促进骨痂矿化和骨折愈合的分子机制[16]。本研究进一步证实了低剂量照射促进破骨细胞分化中P2X7受体的介导作用，是对低剂量射线促进骨愈合系列研究的深入补充。但关于低剂量射线照射激活P2X7受体、MAPK信号通路，级联激活下游功能蛋白，并介导破骨细胞分化与发挥骨吸收功能的具体机制仍需进一步研究证实。

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(学术编辑：陈路)

Action mechanism of low-dose X-irradiation on osteoclast differentiation and functional activity

DENG Ye-kun,ZHOU Xiao-zhong

(DepartmentofOrthopaedics,theSecondHospitalAffiliatedtoSoochowUniversity,Suzhou215004,Jiangsu,China)

Objective：To explore the action mechanism of low-dose X-irradiation (LDI) on osteoclast differentiation and functional activity.Methods：RAW 264.7 cell lines were selected as osteoclast precursors,and they were induced to establish osteoclast models.The osteoclasts were randomly assigned into control group (0 cGy of LDI),irradiation group (10 cGy of LDI) and P2X7-/-irradiation group (shRNA and 10 cGy of LDI).The concentration of adenosin triphosphate (ATP) in culture medium of each group was detected using bioluminescence kit.The maturity of osteoclast differentiation was evaluated by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining,and expressions of P2X7receptor,cathepsin K and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) gene mRNA were determined using real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).Results：LDI significantly improved the release of ATP in cell matrix in irradiation group and P2X7-/-irradiation group,and ATP secretion increased markedly in irradiation group. Morphological experimental results indicated that LDI could improve the capabilities of osteoclast differentiation and bone resorption to some extent.When compared with control group,the mRNA expressions of P2X7receptor and cathepsin K in irradiation group elevated dramatically,whereas those in P2X7-/-irradiation group decreased obviously (P<0.05).No significant difference was shown between irradiation group and control group by comparison to MMP-9 mRNA expression (P>0.05),but the MMP-9 mRNA expression in P2X7-/-irradiation group decreased evidently (P<0.05).Conclusion：LDI can improve the capabilities of osteoclast activity,differentiation and bone resorption by ATP coupling P2X7receptor.

Low-dose X-irradiation;Osteoclast;Adenosin triphosphate;P2X7receptor

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.034

2016-01-18

邓晔坤(1985-)，男，硕士，医师。E-mail：dengyk_mu@163.com通讯作者：周晓中，E-mail: zhouxz@suda.edu.cn

时间：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.068.html

1005-3697(2016)03-0407-04

R814.2；R329.28

A