线粒体转录复合物各因子质粒标准品的构建

罗德艳，冯俊

(川北医学院第二临床医学院·南充中心医院耳鼻喉科，四川 南充　637000)



线粒体转录复合物各因子质粒标准品的构建

罗德艳，冯俊

(川北医学院第二临床医学院·南充中心医院耳鼻喉科，四川 南充637000)

目的：构建大鼠线粒体转录因子TFAM(A)、线粒体转录因子TFB1M (B1)、线粒体转录TFB2M (B2)及线粒体RNA聚合酶(POLRMT)的质粒标准品，为检测内耳细胞线粒体TFAM、TFB1M、TFB2M、POLRMT 的mRNA表达水平做基础。方法：设计特异性引物和探针，提取大鼠内耳组织总mRNA逆转录成cDNA，PCR扩增、纯化目的片段，将纯化产物与pZeroBack/blunt 载体重组，提取重组质粒，经测序鉴定后，用实时荧光绝对定量PCR建立标准曲线。结果：测序结果与各目的序列一致，获得良好的标准曲线(R2>0.99)。结论：成功构建了各目的基因的质粒标准品。

线粒体转录因子A；线粒体转录因子B1；线粒体转录B2；线粒体RNA聚合酶；质粒标准品；实时荧光定量PCR

线粒体通过氧化磷酸化(OXPHOS)产生ATP为细胞提供直能量，OXPHOS过程所需蛋白的其中13个蛋白由线粒体DNA(mtDNA)编码[1-2]。当线粒体蛋白合成受限时，导致氧化磷酸化功能障碍，引起线粒体代谢障碍疾病、癌症、神经变性疾病、老化、年龄相关性疾病，这时负责线粒体基因转录的主要调节显得由为重要[1-3]，所以调节线粒体基因的表达是一潜在的预防、治疗线粒体功能障碍的途径。mtDNA转录激活体系主要有TFAM，POLRMT和TFB2M/TFB1M组成，缺一不可[4-5]。最早发现的线粒体转录因子为TFAM，与HSP和LSP启动子区的调控元件结合后再与POLRMT及其它因子形成转录复合物，启动转录[6]。TFB1M和TFB2M为双功能蛋白，具有同源性，都有甲基化转移酶活性及激活mtDNA转录功能，与TFAM的C端和POLRMT结合，在H链和L链的转录起始位点引发转录，但TFB2M激发转录的效率比TFB1M高[7-8]。POLRMT与T7 噬菌体RNA聚合酶具有同源性[9]，为DNA依赖性酶，但不能自己结合mtDNA而激活其转录，而需要与TFAM，TFB2M/TFB1M结合才能完成这一任务[10]。本研究利用pZeroBack/blunt为载体成功构建大鼠的TFAM、TFB1M、TFB2M、POLRMT的质粒标准品，为研究各线粒体转录因子在内耳的表达水平奠定基础，进一步研究线粒体转录因子在内耳疾病中的作用机制，为内耳疾病的发生机制和防治提供新思路。

1　材料和方法

1.1材料

TOP10感受态细胞、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、ZeroBack Fast Ligation Kit试剂盒、2×Taq PCR MasterMix均购自天根生化科技(北京)有限公司，Trizol RNA提取试剂盒为Invitrogen公司，PCR引物和探针、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Erase、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、DNA Marker均购自日本TaKaRa公司，普通PCR仪Biometra(德国)，实时荧光定量PCR仪ABI(美国)，大鼠由川北医学院动物实验提供。

1.2方法

1.2.1引物和探针在GenBank中查找TFAM、TFB1M、TFB2M、POLRMT基因，获得各目的基因序列，由TaKaRa公司设计并合成引物和探针，见表1。

表1　引物和探针

1.2.2总RNA的提取清洁级大鼠6只，断头处死后立即取出内耳，显微镜下解剖出血管纹、螺旋韧带、基底膜、椭圆囊、球囊等内耳组织，按Trizol RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，-80 ℃保持备用。

1.2.3cDNA的合成反应总体积为20 μL，5×gDNA Erase Buffer 2.0 μL、gDNA Eraser 1.0 μL、Total RNA 5.0 μL、PrimeScript Rt Enzyme MixⅠ1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μL、RNase Free d H2O 6.0 μL，37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 sec、4 ℃ 5 min，在普通PCR仪上逆转录为cDNA，-20 ℃储存备用。

1.2.4目的基因PCR扩增及纯化反应体系总体积为50 μL，cDNA 3 μL，引物2 μL，2×Master Mix 25 μL，dd H2O 20 μL。94 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环，72 ℃延伸 5 min。将扩增产物30 μL上样在3%琼脂糖凝胶进行电泳，按普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的DNA条带，回收的DNA置于-20 ℃保存。

1.2.5重组质粒连接反应按照ZeroBack Fast Ligation Kit试剂盒的说明书进行。将连接产物转化到TOP10感受态细胞，进行氨苄青霉素琼脂糖平板培养，挑选菌落，37 ℃过夜12～16 h。

1.2.6提取质粒及鉴定按质粒小提试剂盒说明书提取质粒，然后进行普通PCR及测序鉴定。阳性质粒经测序后，测定质粒质量浓度。

1.2.7标准曲线的建立采用Premix Ex TaqTM (Probe qPCR)实时定量法配置反应体系后进行实时荧光定量PCR。采用10倍比梯度稀释方法配制各浓度的质粒标准品，共配成7个梯度浓度的标准品作为模板在实时荧光定量PCR仪上扩增。反应总体系为20.0 μL ，Premix Ex Taq(Probe qPCR) (2×) 10.0 μL、上下游引物各0.4 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、Probe 0.2 μL、cDNA template 4.0 μL、ddH2O 4.6 μL。第一步预变性30 s，第二步95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。反应结束后系统自动生成标准曲。

2　结果

2.1电泳检测PCR扩增的目的片段

以cDNA为模板，PCR扩增目的基因片段，取扩增产物30 μL上样3%琼脂糖凝胶电泳，得到目的基因条带，回收目的基因片段经纯化、连接、转化后，提取重组粒进行3%琼脂糖凝胶电泳，结果显示片段与预计大小符合，表明目的质粒重组成功，见图1。

2.2测序结果

将含有目的基因的重组质粒菌液送往武汉擎科生物技术有限公司测序并检测浓度，其结果与GenBank中的各序列对比分析，序列一致，成功构建各目的基因质粒，见图2。

2.3标准曲线的构建

将已知浓度的标准品进行实时荧光定量PCR反应，系统根据初始模板量对数和Ct值的线性关系，系统自动生成标准曲线，见图3。各基因的相关系数R2>0.99，扩增效率在97%～100%，斜率在-3.483～3.308，成功建立了各目的基因的标准曲线，见图3。

3　讨论

实时荧光定量PCR是指在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测PCR进程，荧光信号的强度与产物量成线性关系，通过标准曲线得到样本拷贝数绝对值，从而对起始样本进行定量分析，广泛应用于mRNA的表达，DNA的拷贝数的研究，常用的荧光方法有DNA结合染料法、引物探针法、水解探针法、杂交探针法[11]，分相对定量和绝对定量，两者的区别是绝对定量已知标准品的拷贝数，需要构建目的基因标准质粒和标准曲线[12]。本研究采用绝对定量，使用TaqMan探针法，探针的5′端有报告基团，3′端有淬灭基团，在PCR反应体系中，同时加入引物、特异性荧光探针，退火时引物和探针同时和与模板结合，引物介导模板延伸，当到达探针结合处时Taq酶发挥5′→ 3′ 外切酶活性,切离探针5′端的荧光基团，与3′荧光淬灭基团分离,释放荧光信号[13-14]，所以扩增一条 DNA链, 生成一个荧光分子, PCR 反应结束，荧光基团生成也随即结束，也就是说荧光基团数和PCR产物数一一对应，从而对模板准确定量。

本研究使用的pZeroBack/blunt载体为阳性选择克隆载体，含有致死的限制酶基因(内含多克隆位点)，多克隆位点插入外源片段会引起酶基因失活，只有转化了重组质粒的细菌才能存活形成克隆菌落。而无外源片段插入的 pZeroBack/blunt 载体表达致死的限制酶，转化后杀死大肠杆菌细胞，无需蓝白斑筛选，加速了克隆筛选进程，缩短了实验时间。将重组的质粒10倍连续稀释7个浓度，作为绝对定量PCR的标准模板，反应结束后系统自动生成标准曲线，根据直线方程得到样本拷贝数绝对值,具有高度特异性、高度灵敏性、重复性好、阴性结果确定、操作简便等优点，可长期用于检测。

本实验结果表明CT值在10～35 Hu，可覆盖全部样品浓度区间，R2>0.99, 说明相关系数高，线性关系好，扩增效率>97%,各样本扩增效率一致性强，表明整个实验过和和实验数据是可信的，这些标准品质粒可用于后续的研究。利用实时荧光绝对定量PCR检测不同年龄段大鼠内耳TFAM、TFB1M、TFB2M、POLRMT的mRNA表达水平变化，进行定量分析，较常规的RT-PCR精确。

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(学术编辑：敬保迁)

Construction of each plasmid standard of the mitochondrial transcription complex

LUO De-yan，FENG Jun

(DepartmentofOtolaryngology,NanchongCentralHospital,TheSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To form the basis of detecting the expression of TFAM,TFB1M,TFB2M and POLRMT mRNA of inner ear, the plasmid standards of mitochondrial transcription factor TFAM (A),mitochondrial transcription TFB1M (B1),mitochondrial transcription TFB2M (B2) and mitochondrial RNA polymerase (POLRMT) of rat were constructed.Methods：Specific primers and probes were designed,total mRNA was extracted from rat inner ear tissues and reverse transcribed to cDNA using the specific primers.Purified target fragments from amplified objective gene sequences through PCR were transformed to pZeroBack/blunt vector to establish recombined plasmid.The recombinant plasmids picked out from positive clones were identified by PCR and then sequenced.Using the positive clones,the standards curve of target gene recombinant plasmids were constructed by real-time PCR.Results：The sequencing results were consistent with the objective genes and objective standard curves perfected could be received(R2>0.99).Conclusion：The plasmid standard for each target gene was successfully constructed.

Mitochondrial transcription factor A;Mitochondrial transcription factor B1;Mitochondrial transcription factor B2;Mitochondrial RNA polymerase;Plasmid standard;Real-time fluorescence quantitative PCR

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.030

四川省教育厅项目(13ZB0241)；南充市科技局项目(13A0054)

2015-09-21

罗德艳(1985-)，女，硕士，住院医师。E-mail: lizhiluodeyan@163.com

冯俊，E-mail：flj20041201@163.com

时间：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.060.html

1005-3697(2016)03-00-0

R332

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