氟西汀作用于慢性温和不可预见性应激大鼠海马组织前后的差异蛋白质组学研究

颜因，曹莉莎，李敏，王继生

(1.重庆市第九人民医院，重庆　400700；2.绵阳市第三人民医院，四川 绵阳　621000)



氟西汀作用于慢性温和不可预见性应激大鼠海马组织前后的差异蛋白质组学研究

颜因1，曹莉莎2，李敏2，王继生2

(1.重庆市第九人民医院，重庆400700；2.绵阳市第三人民医院，四川 绵阳621000)

目的：采用蛋白组学方法研究氟西汀对慢性温和不可预见性应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)大鼠海马组织蛋白质表达的影响，以探讨氟西汀抗抑郁的作用机制。方法：采用CUMS建立大鼠抑郁模型。造模完成后，氟西汀组给予氟西汀(3 mg/kg)灌胃给药，每天1次，连续21 d。行为学实验检测大鼠抑郁行为的变化。提取的大鼠海马组织蛋白质样品经同位素标记相对和绝对定量标记、强阳离子柱分离、反相液相色谱分离、质谱分析，获取的串联质谱数据通过Protein.pilot 3.0软件鉴定蛋白质，运用生物信息学分析差异表达的蛋白质功能。结果：共鉴定出5 109个蛋白质，41个差异表达的蛋白质，其中36个蛋白质表达上调，5个蛋白质表达下调，涉及氧化还原、信号传导、合成代谢、对外界刺激压力的反应等过程。结论：同时筛选到了四个可能与氟西汀抗抑郁作用密切相关的差异蛋白，分别是Neuronal calcium sensor 1(NCS-1)、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta、Neurocan core protein和Sodium-and chloride-dependent GABA transporter，但这些蛋白在抑郁症的发生、发展过程中的作用尚未完全清楚，需进一步深入研究。

氟西汀；抑郁；蛋白质组学；海马组织；同位素标记相对和绝对定量

氟西汀是一种强效的、选择性5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂，通过高度选择性抑制突触前膜对5-HT的再摄取而发挥抗抑郁作用。临床上广泛用于治疗各种抑郁性精神障碍。虽然氟西汀的抗抑郁效果非常显著，但也存在药效延迟、部分抑郁患者疗效不佳、复发率高等现象。氟西汀抗抑郁作用的关键蛋白及其启动机制至今无明确报道，找到氟西汀作用的关键蛋白，明确其作用机制，对我们研究新型抗抑郁药物有着至关重要的作用。

同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,ITRAQ)联合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的方法是研究药物作用的关键蛋白，发现蛋白标志物的强有力工具。该方法可同时对多达8种样品进行定量研究，并且对低丰度蛋白检测的灵敏度高，重复性好[1]。可同时分离和鉴定成百上千的蛋白质，最大化的获得蛋白质的“全组信”[2]。本研究以ITRAQ1技术联合LC-MS/MS技术分析氟西汀作用于慢性温和不可预见性应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)大鼠海马组织后的差异表达蛋白，以进一步探讨氟西汀抗议与作用过程中的关键蛋白及机制。

1　材料与方法

1.1实验动物

清洁级♂SD大鼠共40只，体重180～220 g,从重庆医科大学实验动物中心购买，合格证书编号SCXK(渝)2012-0001。实验室环境温度25 ℃，给予所有大鼠正常饮食饮水，实验室内黑暗与光照交替出现，黑暗12 h，光照12 h，所有大鼠饲养1周适应环境。

1.2实验试剂与仪器

H20(HPLC级别)(美国Sigma公司)，ITRAQ 标记试剂盒(美国Applied Biosystems公司)，BCA试剂盒(中国碧云天公司)，胰酶(美国Sigma公司)，Cocktail蛋白酶抑制剂(美国罗氏公司)，全蛋白提取试剂盒(上海生工)，蛋白裂解液(中国碧云天公司)，尿素(美国Sigma公司)，Anti-GABA Transporter(ab431)，聚偏氟乙烯膜(PVDF)0.45 μm(Merck Millipore,IPVH00010)，SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5×)(碧云天生物技术研究所，P0015)，鲁米诺化学发光液底物100 mL(Merck Millipore,WBLUC0100)，TBST缓冲液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，电泳/电转仪(BIO-RAD公司，041BR88778)。旷场实验行为测试仪，强迫游泳行为测试仪，高架十字迷宫(重庆医科大学药理实验室制)。低温冰箱(-20 ℃)(德国西门子)，Aallegra台式高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)，超低温冰箱(-80 ℃)(美国Thermo Fisher)，高效液相色谱仪(岛津半制备型HPLC系统)，RVT4104低温冷冻干燥器(美国Thermo Fisher)，SpeedVac真空离心器(美国Applied Biosystems公司)，MALDI/TOF/TOF5800蛋白分析仪及配套软件Mascot软件(美国Applied Biosystems公司)。

1.3实验方法

1.3.1CUMS大鼠模型按照文献方法[3]进行抑郁症大鼠模型的复制。♂SD大鼠共40只，先进行旷场试验评分，采用随机区组设计，按旷场试验结果将其分为正常组和模型组，每组20只。正常组正常饲养，模型组接受21 d各种不同温和刺激，包括禁水24 h, 禁食24 h，4 ℃冰水游泳5 min，昼夜颠倒，热刺激(45 ℃，5 min)，湿垫料，异味刺激，45°鼠笼倾斜24 h，每天随机选择一种刺激，相同刺激不得重复出现，同种刺激不能超过3次。

造模完成后，即第22天，进行旷场实验、强迫游泳实验、高架十字迷宫等行为学实验以判断造模是否成功。模型成功后，将模型组大鼠随机分类两组即氟西汀组和抑郁组，每组10只。氟西汀组给予氟西汀(3 mg/kg)灌胃给药，抑郁组给予等体积生理盐水，每天1次，连续21 d。实验结束后，大鼠断颈处死，冰台上迅速分离出海马组织，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。

1.3.2海马组织蛋白质的提取lysis buffer中加入5 μL磷酸酶抑制剂、1 μL蛋白酶抑制剂和10 mL 苯甲基磺酰氟(PMSF)混匀；冰上预冷玻璃匀浆器，2支lysis buffer；取冻存的大鼠海马组织每组3只，PBS清洗，按组放入玻璃匀浆器，分别加预冷的lysis buffer，手动研磨，致均质匀浆；加入TCA-冰丙酮，-20 ℃沉淀2 h后，3 000 rpm,4 ℃，离心30 min,弃上清液，取沉淀。再加入丙酮，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，离心30 min，反复操作，至沉淀变为白色。-80 ℃冻存。

1.3.3ITRAQ标记蛋白溶解，定量：取冻存的两组样品，各加入40 mL裂解液和20 mL变性剂，震荡混悬溶解，离心去除沉淀。用Bradford法进行蛋白定量，调整溶液的蛋白浓度，使每组蛋白样品量为40 μg，体积20 μL；还原，封闭：按试剂盒提供方案进行还原、封闭；酶解：向各组蛋白溶液中加入1 μg胰酶，37 ℃温育16 h；标记：各试管标记试剂中加入50 μL乙丙醇，混匀，分别加入各管样品中，室温反应1 h，之后各加入3倍体积水，使标记试剂分解。真空冷冻干燥；除盐：将相关buffer和标记试剂的盐除去。

1.3.4肽段的分离和鉴定(1)第一维强阳离子柱(SCX)分离：流动相A液：10 mMKH2PO4，25% CAN，pH=2.6；B 液：10 mMKH2PO4，350 mMKCl和25%ACN，pH=2.6。80 μL A液中溶解冻干样品，上样。将紫外检测波长设置为214 nm/280 nm，然后将流速设置为200 μL/min。线性梯度洗脱：5～40 min，5%～25% B；40～45 min，25%～80% B；45～50 min，80% B；50～60 min，0%B。根据峰形和时间共收取20个梯度，真空离心浓缩后，每馏分用50 μL反相液相色谱的A相溶解，进样量20 μL。(2)第二维反相液相色谱：流动相A液包含：5% (体积分数)乙腈和0.1% 甲酸溶液。流动相B液包含：95% 乙腈和0.1% 甲酸溶液。RPLC柱线性梯度洗脱：0～5 min，上样； 5～70 min，5%～35% B；70～75 min， 35%～80% B；75～80 min，80% B； 80～81 min， 80%～5% B；90 min 停止。(3)质谱鉴定：喷雾针直接连接于反相色谱柱末端作为喷雾接口，喷雾电压2.2 kV。MS扫描范围：400～1 800 m/z，一个谱图选择4个最强母离子进行串级扫描，MS/MS扫描范围100～2 000 m/z。

1.3.5生物信息学鉴定利用Protein.pilot 3.0软件检索质谱分析所得数据，差异蛋白筛选标准设定为：(1)肽段≥3；(2)模型组与正常组大鼠海马组织蛋白分子质量比≥2.0或≤0.5；(3)P<0.05。运用Uniport软件分析各蛋白生物学过程及分子功能，运用David软件从生物过程，细胞成分，分子功能注释对蛋白进行分类，选择KEGG数据库对蛋白所涉及的通路进行分类和富集分析。

1.3.6Western-blot验证通过文献检索选择了差异蛋白Sodium-and chloride-dependent GABA transporter 3进行Western-blot验证。按照碧云天SDS-PAGE凝胶试剂盒提供配方制备凝胶；选取冻存大鼠海马组织每组3只，提取蛋白并定量，调整每管蛋白浓度致均值，加入含2-巯基乙醇和溴酚蓝的2×蛋白上样缓冲液，100 ℃孵育10 min， 冷却到室温后，将变性蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内；蛋白上样后电压设置在100 V，时间设定为90～120 min，当溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳；然后经过转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育，按1∶1加入AB显影液，室温放置5 min后，吸尽膜上水分，将膜放入暗盒，曝光5 min在Bio-Rad 的化学发光成像仪上显影然后分析灰度值，再进行计算灰度系数比。

2　结果

2.1行为学实验结果

根据前期的研究结果显示[4]，21 d造模后，在旷场实验中，模型组大鼠水平运动和垂直运动次数较正常组减少。在强迫游泳实验中，模型组大鼠禁止不动时间较正常组增加。在高架十字迷宫实验中，模型组大鼠进入开臂的次数及停留时间百分率明显缩短，进入高架十字迷宫总次数明显减少。说明CUMS致大鼠出现抑郁行为，模型建立成功。21 d氟西汀灌胃给药后，氟西汀组大鼠抑郁行为得到明显改善。

2.2ITRAQ实验结果

本实验基于ITRAQ技术联合LC-MS/MS技术对氟西汀作用于CUMS大鼠后海马组织内蛋白质表达的影响进行了差异分析。总共鉴定到5 109个蛋白，氟西汀组标记为119，模型组为121，设定蛋白丰度差异≥2.0倍(上调)；<0.5倍(下调)，且经统计检验其P<0.05为差异蛋白。共鉴定出差异蛋白41个，其中表达上调的蛋白有36个；表达下调的蛋白有5个，Uniport数据库分析各个蛋白生物学过程及分子功能，见表1。

表1　Uniport数据库分析各个蛋白生物学过程及分子功能

2.3生物学功能分析

通过David富集分析系统对41个差异蛋白进行GO分析和Pathway分析，通过GO分析发现这些蛋白共参与了29种生物学过程，31种细胞组分和17种分子作用，生物学进程分析(BP)分析发现差异表达蛋白主要参与了氧化还原、信号传导、合成代谢、对外界刺激压力的反应等。细胞成分分析(CC)分析得出差异蛋白广泛分布在细胞膜、细胞质及细胞器内。分子功能分析(MF)分析得出这些蛋白的功能大多与离子束缚及核苷酸结合位点相关，见图1。通过KEGG PATHWAY发现，共有19个蛋白参与了3条生物代谢通路。这3条通路分别是：柠檬酸循环、脂肪酸代谢及抗原加工提呈。

2.4Western-blot实验结果

ITRAQ实验结果显示，蛋白Sodium-and chloride-dependent GABA transporter 3在氟西汀组大鼠海马组织中表达下调，且比值为0.37。Western-blot实验结果表明相对于CUMS大鼠海马组织，蛋白Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 3在氟西汀组大鼠海马组织中明显低表达。见图2。

3　讨论

有研究者发现氟西汀能够增高CUMS大鼠海马细胞神经生长因子(NGF)阳性表达。NGF在体内分布广泛，具有营养神经元及促突起生长双重生物学功能，NGF含量的高低与抑郁症密切相关，这也可能是氟西汀抗抑郁的作用机制之一[5]。为深入探讨氟西汀的抗抑郁作用机制，本实验采用ITRAQ技术联合LC-MS/MS技术分析氟西汀作用于CUMS大鼠后海马组织蛋白的表达变化及这些差异表达蛋白与抑郁的关系。共鉴定出41个差异蛋白，其中表达上调36个，表达下调5个。通过GO分析发现这些差异蛋白主要参与了氧化还原、信号传导、合成代谢及对外界刺激压力的反应等生物学过程。通过KEGG发现这些差异蛋白总共参与3条代谢通路。这3条通路分别是：柠檬酸循环、脂肪酸代谢及抗原加工提呈。参与柠檬酸循环相关的主要的3个蛋白是Isocitrate dehydrogenase [NADP],Aconitate hydratase和Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex，这3个蛋白均是高表达，有利于柠檬酸循环的顺利进行，保证机体的能量供应。kaibara等[6]发现该循环与抑郁症的发生发展密切相关。参与脂肪酸代谢主要的3个蛋白是Enoyl-CoA delta isomerase 2，Trifunctional enzyme subunit alpha和Acetyl-CoA acetyltransferase，流行病学和饮食研究均显示n-3系多元不饱和脂肪酸的缺乏与抑郁症的发生和严重程度直接相关，而且存在反比关系[7]。本实验发现参与脂肪酸代谢的这3个蛋白均高表达，但这些蛋白对脂肪酸代谢的影响及是否与抑郁症的发生发展有关联还待进一步研究。参与抗原加工提呈主要的3个蛋白是Calreticulin，Protein disulfide-isomerase A3和78 kDa glucose-regulated protein。均高表达。

结合GO分析，KEGG PATHWAY及Uniport分析结果发现4个差异蛋白可能与氟西汀抗抑郁作用密切相关。这4个蛋白是Neuronal calcium sensor 1(NCS-1)、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta、Neurocan core protein和Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 3可能直接参与了氟西汀抗抑郁的过程。经蛋白质功能分析发现蛋白NCS-1参与了钙离子跨膜运输，负调节蛋白激酶活性，调节神经元投射等生物学过程。de Rezende 等[8]也发现NCS-1不足时能够引起类似焦虑、抑郁等行为，并且会损伤小鼠的记忆力。Amici 等[9]也证实NCS-1在调节突出可塑性的初始部分信号通路中起着关键作用。Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta与脑发育，学习记忆，海马发育，轴突束状，神经元发育，少突细胞分化，树突发育，调控神经元死亡，神经元投射，监管纤维母细胞增值等有着密切的关系。有研究者发现大鼠额前皮质高亲和力受体酪氨酸激酶蛋白的表达减少与脑卒中后抑郁的发生直接相关[10]。Neurocan core protein可以调节神经黏连和神经突触的生长。Dimatelis 等[11]发现Neurocan core protein参与调节大鼠母婴分离所带来的焦虑及抑郁症状。蛋白Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 3对GABA的运输与钠离子同向转运活动密切相关，并且对其有高度的亲和力，极易被再摄取到突触前膜，终止GABA的活动，降低突触间隙GABA的含量，加重抑郁。本研究发现氟西汀组大鼠海马组织NCS-1、Neurocan core protein和Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta表达远远高于抑郁组。而Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 3的含量确远远低于抑郁组。与国内外研究人员所发表的结果相符合。

综上所述，本研究通过ITRAQ技术联合LC-MS/MS技术分析氟西汀抗抑郁作用机制，获得了一系列与抑郁症相关的差异表达蛋白，表明了该技术用于药物抗抑郁蛋白质组学研究具有良好的前景。同时发现了氟西汀抗抑郁的一些重要蛋白，但这些蛋白在抑郁症的发生、发展过程中的作用尚未完全清楚，需进一步深入分析。

[1]李敏,姜鹏,王淑萍,等.蛋白质组学在中药研究中的应用[J].药学实践杂志,2013,31(4):76-82.

[2]王林纤,戴勇，涂植光．ITRAQ 标记技术与差异蛋白质组学的生物标志物研究[J]．生命的化学,2010,30(1):135-140．

[3]Willner P,Towell A,Sampson D,etal.Reduction of sucrose preference by chronic mild unpredictable stress and its restoration by a tricyclic antidepressant[J].Psychopharmacology,1987,93(3):358-64.

[4]曹莉莎,罗文,王继生,等.尼美舒利对慢性应激大鼠抑郁行为的影响[J].中国医院药学杂志,2014,34(11)：890-895.

[5]宋晓灵,张芳,王继生,等.氟西汀对抑郁大鼠模型海马CA1区CA3区及齿状回区神经生长因子表达的影响[J].武汉大学学报,2015,36(2)：185-188.

[6]Kaibara T,Sutherland GR,Colbourne F,etal.Hypothermia: depression of tricarboxylic acid cycle flu x and evidence for pentose phosphate shunt upregulation[J].Journal of Neurosurgery,1999,90(2):339-347.

[7]郭小月,任俊,郭建友.n-3 系多元不饱和脂肪酸对抑郁症的影响及其机制[J].心理科学进展,2013,21(3)：458-467.

[8]de Rezende VB,Rosa DV,Comim CM,etal.NCS-1 deficiency causes anxiety and depressive-like behavior with impaired non aversive memory in mice[J].Physiol Behav,2014,130(10):91-99.

[9]Amici M,Doherty A,Jo J,etal.Neuronal calcium sensors and synaptic plasticity[J].Biochem Soc Trans,2009,37(6):1359-1363.

[10]李云,郭旭,李永刚.脑卒中后抑郁大鼠额前皮质脑源性神经营养因子和酪氨酸激酶受体B蛋白的表达变化[J].中华行为医学与脑科学杂志，2013，22(6)：507-509.

[11]Dimatelis JJ,Hendricks S,Hsieh J,etal.Exercise partly reverses the effect of maternal separation on hippocampal proteins in 6-hydroxydopamine-lesioned rat brain[J].Exp Physiol,2013,98(1):233-244.

(学术编辑：邓世山)

Proteomics study of effects of fluoxetine on expression of proteins in hippocampus tissues of CUMS rats

YAN Yin1,CAO Li-sha2,LI Min2,WANG Ji-sheng2

(1.TheNinthPeople′sHospitalofChongqing,Chongqing400700;2.TheThirdPeople′sHospitalofMianyang,Mianyang621000,Sichuan,China)

Objective：The effects of fluoxetine on expression of proteins in hippocampus tissues of chronic unpredicted mild stress(CUMS) rats by proteomics study were studied to explore the anti-depression mechanism.Methods：CUMC was taken to establish rat depression model.Rats in fluoxetine group were administrated with fluoxetine (3 mg·kg-1·d-1) after stress procedure for 21 day .The extractd proteins from hippocampus tissues were digested by equal amount of trypsin and identified by ITRAQ coupled with the cation column and LC-MS/MS technology and then analyzed by Protein Pilot 3.0 search engine.Using bioinformatics to analyze differentially expressed proteins.Results：A total of 5109 proteins were identified,including 41 significantly differentially expressed proteins,which 5 proteins were down-regulated and 36 were up-regulated and involves redox reactions,signal transduction,anabolic metabolism,pressure to external stimuli of reaction process.Conclusion：Screening to four possible with fluoxetine antidepressant effect is closely related to the differences in protein,respectively is Neuronal calcium sensor 1 (NCS-1),Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta,Neurocan core protein and Sodium- and chloride-dependent GABA transporter,but these proteins in the role in the process of the occurrence and development of depression is still not clear and need further study.

Fluoxetine;Depression;Proteomics;Hippocampus;Isobaric tags for relative and absolute quantification

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.014

四川省卫生厅科研课题(120320)

2016-01-06

颜因(1978-)，女，硕士，主治医生。E-mail:yanyin616@sina.com通讯作者：曹莉莎，E-mail:285714739@qq.com

时间：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.028.html

1005-3697(2016)03-0336-06

R749.4

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