去铁胺减少老年大鼠急性脑出血后神经元凋亡作用及其机制

常远,王敏娟

(1.西安医学院临床医学院,陕西 西安　710021;2.西安医学院第一附属医院 老年病科,陕西 西安　710077)



去铁胺减少老年大鼠急性脑出血后神经元凋亡作用及其机制

常远1,王敏娟2

(1.西安医学院临床医学院,陕西 西安710021;2.西安医学院第一附属医院 老年病科,陕西 西安710077)

目的：探讨去铁胺(deferoxamine,DFX)降低急性脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)诱导的神经元凋亡作用及其机制。方法：雄性SD大鼠右侧基底节区尾壳核注射100 μL自体全血，随机分为观察组和对照组。观察组ICH后2 h注射DFX，以后每12 h注射一次，直至7 d；对照组注射等量生理盐水(normal saline,NS)。两组均在ICH后1、3、7 d进行行为学检测，并检测血肿大小、神经元凋亡、铁蛋白、血浆铁蛋白水平。结果：观察组ICH后7 d前肢放置明显恢复(P<0.01)，ICH后3、7 d右转百分比明显降低(P<0.01)；ICH后7 d，观察组血肿分辨率明显降低(P<0.01)；ICH后1 d，观察组TUNEL阳性细胞数显著降低(P<0.05)，但ICH后3 d，两组TUNEL阳性细胞数差异无统计学意义(P>0.05)；观察组铁蛋白重链和轻链表达显著减少(P<0.05)；血浆铁蛋白水平在ICH后3、7 d有所降低，但与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论：DFX缓解老年大鼠急性ICH后神经细胞凋亡及神经功能缺损，可能是通过影响急性ICH的内源性反应而发挥保护作用。

急性脑出血;去铁胺;凋亡;老年鼠

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一种常见的卒中类疾病，通常导致严重的神经功能损伤，尽管过去20年在卒中治疗方面已取得较大进步，但ICH后30 d内死亡率并未明显降低[1]。目前降压治疗成为ICH急性期最主要的治疗方法[2]，但过度降压可导致急性脑缺血，加剧ICH后脑损伤[3]。据报道[4]，铁螯合剂去铁铵(deferoxamine，DFX)可减少年轻大鼠ICH或血红蛋白诱导的脑水肿、神经元死亡、神经功能缺损和脑萎缩。但ICH主要是老年疾病，年龄也是ICH后脑损伤的主要因素。有研究[5]发现，DFX可降低老年大鼠ICH后行为障碍和脑萎缩，但其对老年大鼠ICH后神经元损伤的影响未见相关报道。本研究评价了DFX对老年大鼠ICH后神经元凋亡及内源性反应的影响，旨在探讨DFX减少ICH后脑损伤作用及其机制。

1　材料与方法

1.1材料

40只雄性SD大鼠(由西安医学院第一附属医院动物中心提供)，12个月，体质量250～300 g，自由饮水摄食，饲养温度20～30℃。

动物脑立体定位仪(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；注射用DFX(瑞士诺华制药有限公司，注册证号H20091034)；TUNEL凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；铁蛋白酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)；铁蛋白重链(ferritin heavy chain, FTH)抗体、骨骼肌蛋白FHL抗体(美国Sigma公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠ICH模型制备及分组术前8 h禁食，不禁水，水合氯醛35 mg/kg腹腔注射麻醉，立体定位仪固定，头部正中纵形切口，暴露前囟和冠状缝，冠状缝前0.2 cm、中线旁开0.4 cm处用直径1 mm牙钻钻开颅骨至硬脑膜，将静脉留置针垂直插入脑尾壳核内。用温水加温鼠尾，待充血后乙醇消毒，距尾部2 cm处剪断鼠尾，用微量注射器取未凝血100 μL，2 min内均匀注入右侧基底节区尾壳核内。术后用骨蜡封闭颅骨创口，缝合皮肤[6]。将大鼠随机分为观察组和对照组，各20只。观察组在ICH后2 h肌肉注射DFX 100 mg/kg，以后每12 h注射一次，直至7 d，对照组注射等量生理盐水(normal saline，NS)。

1.2.2行为学检测ICH前及ICH后1、3、7 d进行行为学检测。①前肢放置实验：使用撩拨触须引发前肢放置而进行评分，记录每个前肢通过每次撩拨同侧触须引发同侧肢体放置桌面的次数，重复测量10次。②转角实验：将大鼠放入30°角落里，大鼠通过左转或右转才能走出角落，记录其向两侧转身的次数。重复10次，每次测验间隔至少30 s，计算右转的比例。

1.2.3血肿体积ICH后1、3、7 d，处死大鼠，冷冻大脑并切片。起始于前囟2 mm，延伸至后面4 mm，20 μm切片，HE染色并扫描。Image J软件检测血肿轮廓，重复3次，取均值。

1.2.4TUNEL染色ICH后1、3 d，采用原位细胞凋亡检测试剂盒的过氧化物酶DNA碎片评估。步骤如下：组织切片，附在载玻片上，4%多聚甲醛固定ProteinK，滴加50 μL的TdT酶反应液于样本区域上，37 ℃、潮湿环境中反应60 min；POD 1 h，37 ℃、避光；PBS浸洗3次，每次5 min；于载玻片的样本区域滴加100 μL DAB工作液(直到呈现浅棕色背景)；去离子水漂洗2～3次，滴加几滴甘油于样本区域，盖上盖玻片进行封片，即刻在光学显微镜下进行观察并拍照。

1.2.5Western blot分析ICH后7 d，取出大鼠右侧基底节区尾壳核脑组织，按10 mL/g比例加入全细胞裂解液。匀浆、超声破碎，待细胞全部溶解后。BCA法进行蛋白定量，加入Loading Buffer制备成电泳样品，10%凝胶电泳，PVDF转膜，10%脱脂牛奶封闭1 h。加FTH、FTL抗体(1∶1 000)室温下孵育3 h，加入1∶5 000的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG中，孵育1 h。弃二抗，根据ECL试剂盒的反应步骤，得到显示特异蛋白条带的X光片。所得X-光胶片结果用Gel Doc凝胶成像分析系统扫描，并应用Quantity One软件进行半定量分析。

1.2.6免疫组化检测ICH后7 d，麻醉大鼠，4%多聚甲醛灌注，取出鼠脑，4%多聚甲醛固定过夜后，30%蔗糖浸泡3～4 d，4 ℃脱水，OCT包埋，20 μm切片，免疫组化染色用，一抗为多克隆兔抗人铁蛋白IgG，二抗为生物素标记的山羊抗兔IgG，正常兔IgG作为阴性对照。

1.2.7血浆铁蛋白检测ICH后1、3、7 d，麻醉大鼠，取全血，采用铁蛋白ELISA试剂盒检测血浆铁蛋白水平。

1.3统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，定量资料以均数±标准差描述，组间比较采用t检验或基于秩次的重复测量方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1ICH后行为学检测

对照组前肢放置未见好转，而观察组ICH后7 d前肢放置明显恢复(3%/25%，P<0.01)，见图1A；转角实验中，观察组在ICH后3 d(95%/83%，P<0.05)、7 d(90%/75%，P<0.05)右转百分比明显降低，见图1B。

2.2血肿体积变化

ICH后1、3d，观察组和对照组血肿体积无统计学差异(P>0.05)；ICH后7 d，观察组血肿体积增加(4 mm3/15mm3，P<0.01)。见图2。

2.3ICH诱导神经元凋亡

ICH后1 d，观察组TUNEL阳性细胞数显著降低(298/mm2vs 145/mm2，P<0.05)；ICH后3 d，观察组和对照组TUNEL阳性细胞数差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.4ICH后内源性铁蛋白变化

Western blot结果显示，DFX处理会显著减少铁蛋白重链(3 480/2 450，P<0.05)和轻链表达(3 460/2 000，P<0.05)，见图4。

2.5ICH后血浆铁蛋白水平

观察组血浆铁蛋白水平在ICH后3、7 d有所降低，分别为(282±62)ng/mL、(335±79)ng/mL，对照组分别为(630±730)ng/mL、(559±439)ng/mL，两组差异无统计学意义(P>0.05)。

3　讨论

红细胞溶解和铁的毒性有助于ICH后脑损伤[7]。铁蛋白是自然产生的铁螯合剂，参与脑内铁稳态的维持。铁蛋白由2个亚型组成：重链和轻链。重链和轻链具有不同的功能，重链具有亚铁氧化酶活性，催化可溶的二价铁离子氧化不溶的三价铁离子；而轻链参与铁核心的形成，矿化作用及铁的长期储存[8]。ICH患者血清铁蛋白水平与血肿周围水肿体积及预后具有相关性[9]。但DFX对铁蛋白上调和血肿清除激活等ICH内源性反应的影响目前尚不清楚。

本研究发现，DFX治疗能够改善老年大鼠ICH模型神经元凋亡和神经功能障碍，提示铁螯合疗法可用于治疗急性期的脑出血。DFX也影响到ICH引起的内源性反应，抑制铁蛋白上调并延缓老年大鼠血肿分辨率。然而，很难评价DFX在血液注入模型对ICH诱导的死亡率的影响，因为ICH模型在老年鼠和年轻鼠的死亡率都很低。人的平均寿命是70年，一个雄性大鼠的平均寿命是2年或3年。12个月大鼠相当于人类的50岁。大脑内注射自体血后引起脑组织氧化损伤和神经细胞凋亡[10]。铁诱导的脑损伤可能由于激活氧化应激，也可能是由于游离铁促进氧自由基形成，氧化应激下损伤DNA。

DFX是铁螯合剂，其分子量为657 KD，全身给药后DFX能够迅速穿透血脑屏障，在脑组织中积累。本研究选择DFX的注射剂量为100 mg/kg，因为有研究[5]表明，这个剂量可以有效减少年轻或老年大鼠ICH引起的脑损伤。本研究中，TUNEL阳性细胞数在ICH后1 d达到顶峰，而DFX能够降低ICH后1 d时TUNEL阳性细胞数，表明DFX可以降低老年大鼠ICH模型神经元死亡。本研究使用感觉运动行为试验评价ICH后神经功能缺损，结果显示，DFX能够改善老年大鼠前肢放置实验和转角实验的分数。

ICH后产生一系列脑损伤保护机制。铁蛋白，一种自然产生的铁螯合剂，参与维持脑铁代谢，且大脑能产生铁蛋白。铁蛋白有2个亚基：铁蛋白重链，与铁的利用率相关；铁蛋白轻链，与铁的存储有关[11]。铁蛋白合成主要是通过铁或非铁介导的转录后调节，而且脑内铁蛋白水平上调可能参与神经保护[12]。脑内铁蛋白水平在ICH后逐步增加。本研究发现，DFX处理显著降低了老年大鼠ICH后7 d脑铁蛋白水平，表明DFX可以降低老年大鼠ICH模型的铁超载，从而降低对铁蛋白的诱导。此外，DFX对ICH后1 d的神经元凋亡有明显效果，之前铁蛋白大幅度上调，提示DFX可以螯合从血肿释放出的铁。

临床研究中，高血浆铁蛋白水平与ICH患者预后不良相关[9]。此外，血浆铁蛋白水平与ICH患者血肿周围水肿体积也存在正相关[13]。本研究中，ICH后3、7 d血浆铁蛋白水平降低，但与对照组比较，差异无统计学意义，需要进一步研究来确定上调血浆铁蛋白水平在ICH后的作用机制。

总之，DFX全身注射后能够减少ICH引起的老年大鼠神经元凋亡和神经功能缺失，提示DFX可以降低ICH诱导的脑损伤，其机制主要是通过抑制ICH的内源性反应，抑制铁蛋白上调和减少血肿清除率。

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(学术编辑：吴碧华)

Effect of deferoxamine on the reduction of neuronal apoptosis in the aged Rats with acute intracerebral hemorrhage and its mechanism

CHANG Yuan1,WANG Min-juan2

(1.ClinicalMedicineCollege，Xi′anMedicalUniversity，Xi′an710021;2.DepartmentofGeratology，TheFirstAffiliatedHospitalofXi′anMedicalUniversity，Xi′an710077，Shaanxi，China)

Objective：To explore the effect of deferoxamine (DFX) on the reduction of neuronal apoptosis in the aged rats with acute intracerebral hemorrhage (ICH) and its mechanism.Methods：Autologous blood 100 μL was injected into the caudate putamen in the right basal ganglia region of male SD rats.After that,the rats were randomly assigned into observation group and control group.In observation group,DFX was injected 2 h after ICH,then once every 12 h until 7 d.The same amount of normal saline (NS) was injected into the rats in control group.The behavioristics were detected in both groups 1,3 and 7 d after ICH,and the hematoma size,neuronal apoptosis and levels of ferritin and plasma ferritin were also detected.Results：In observation group,the forelimb placement recovered obviously 7 d after ICH (P<0.01),the percentage of dextroversion decreased dramatically 3,7 d after ICH (P<0.01),and the hematoma resolution reduced significantly 7 d after ICH (P<0.01).The number of TUNEL positive cells in observation group decreased markedly 1 d after ICH (P<0.05),but there was no statistical significance between two groups by comparison to the number of TUNEL positive cells 3 d after ICH (P>0.05).The expression of ferritin heavy chain and ferritin light chain in observation group went down significantly (P<0.05);3 and 7 d after ICH,the level of plasma ferritin decreased slightly,but the difference wasn′t statistically significant by comparison to the control group(P>0.05).Conclusion：DFX can alleviate neuronal apoptosis and neurologic impairment of aged rats with acute ICH,which exerts a protective effect possibly by impacting the endogenic reaction of acute ICH.

Acute intracerebral hemorrhage;Deferoxamine;Apoptosis;Aged rats

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.011

陕西省教育厅专项科研计划项目(2010JK808)；西安医学院科研基金青年项目(2007QN02)；西安医学院附属医院科研基金项目(XYFY08-08)

2016-01-26

常远(1987-)，女，硕士，助教。通讯作者：王敏娟，E-mail：yl_wmj@163.com

时间：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.022.html

1005-3697(2016)03-0324-04

R743.3

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