树突状表皮T淋巴细胞对糖尿病小鼠创面的治疗效果

刘美希刘中阳李雅舒白杨罗高兴吴军贺伟峰

树突状表皮T淋巴细胞对糖尿病小鼠创面的治疗效果

刘美希1刘中阳2李雅舒1白杨1罗高兴1吴军1贺伟峰1

目的 建立体外大量扩增高纯度小鼠树突状表皮T淋巴细胞（DETCs）培养技术，并证实外源性给予DETCs能够有效促进糖尿病小鼠创面愈合。方法 通过流式细胞技术及Western Blot方法分析糖尿病及正常小鼠表皮组织中DETCs比例和IGF-1/KGF-1表达情况。体外培养扩增获得大量高纯度DETCs后，局部植入糖尿病创缘皮下，创面未愈合面积采用单因素方差分析，通过图像分析软件Image-pro plus分别统计每组5只糖尿病小鼠每天创面面积与红色标尺面积之比数据统计分析。结果 对比正常小鼠，糖尿病表皮组织中DETCs比例和IGF-1/KGF-1表达均显著降低；体外培养能够获得大量高纯度DETCs（＞ 95%）；创缘局部植入DETCs后能够显著增强糖尿病创缘皮肤表皮组织IGF-1/KGF-1的表达，并从第2天，对照组创面面积与红色标尺面积比为0.769 ± 0.034，实验组创面面积与红色标尺面积比为0.692 ± 0.038，到第7天对照组创面面积与红色标尺面积比为0.178 ± 0.024，实验组创面面积与红色标尺面积比为0.011 ± 0.003，实验组创面比对照组创面愈合面积显著加速。结论 外源性给予DETCs能够显著改善糖尿病创面愈合，可能为临床糖尿病难愈创面治疗提供新的思路。

糖尿病； 创口愈合； T淋巴细胞； 胰岛素样生长因子Ⅰ

作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院全军烧伤研究所1；510080 广州中山大学第一附属医院烧伤科2

创面延迟愈合是糖尿病患者中最常见的皮肤病学并发症，这严重加大了医疗压力和社会经济负担［1］。糖尿病造成患者足部溃疡和截肢的发病率一直在增加［2］。糖尿病患者伤口难愈合的机制尚未完全清楚［3］。此外，糖尿病创面有效的治疗方法在临床实践中是一个巨大且有挑战的问题［4］。

树突状表皮T淋巴细胞（dentritic epidermal T lymohocytes，DETCs）交错分布于表皮组织中，表达Vγ3Vδ1T细胞受体（T cell receptor，TCR）是表皮中最主要的T淋巴细胞［5］。目前研究表明DETCs主要通过分泌IGF-1/KGF-1在创面愈合中起重要作用。而在表皮组织中，DETCs是产生IGF-1和KGF-1最主要的效应细胞［6-7］，但DETCs是否能够有效促进糖尿病创面愈合目前尚不清楚。由于皮肤表皮组织主要由大量的角质形成细胞构成，而γδT细胞所占比例很低（＜ 7%）［5］。如何通过原代培养技术大量获得高纯度DETCs已经成为限制对其进一步研究及应用的关键问题。

材料与方法

一、材料

1.实验动物：健康雄性C57BL/6小鼠，38只，体质量18 ～ 22 g，8周龄，均购于第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心，动物合格证书号SCXK（京）2009-0007。

2.试剂及仪器：培养基RPIM1640（美国Gibco公司）、FBS（美国Gibco公司）、DispaseⅡ（德国Roche公司）、吲哚美辛（indomethacin，美国Sigma公司）、小鼠重组IL-2（美国R&D公司）、刀豆蛋白A（ConA，美国Sigma公司）、Lympholyte-M（加拿大Cedarlane公司）、anti-CD 16/32（Clone 2.4G2，中国天津三箭公司）、PE-CY5-anti-γδTCR（Clone GL3，中国天津三箭公司）、PE-anti-CD3ε（Clone 145-2C11，中国天津三箭公司）、Attune流式细胞仪（美国ABI公司）。

二、方法

1. DETC分离及原代培养：野生型C57BL/6小鼠脱毛备皮1 d后，断颈处死。取小鼠躯干皮肤全层，尽量去除皮下组织，切成1 cm×1 cm的组织小块，将小鼠耳朵剪下用眼科镊分为背侧瓣和腹侧瓣。 将上述皮片表皮面向上浸泡于0.5% DispaseⅡ中 4℃过夜消化，然后用眼科镊分离表皮置于含5% FBS的PBS中。将分离好的表皮用眼科剪剪碎，然后采用0.3%的胰酶/GNK（无水葡萄糖、Nacl、 Kcl）溶液37℃震荡消化15 ～ 20 min，2倍血清培养基终止后吹打，最后经40 μm滤网过滤即可获得小鼠表皮细胞悬液。Lympholyte-M密度梯度离心法纯化目的细胞，RPIM-1640完全培养基重悬细胞并调整细胞数为106/ml。若用于培养，即向培养基中加入2 μg/ml ConA和2 μg/ml indomethacin，并将细胞接种至48孔板中培养4周得到纯度达98%的目的细胞。

2. DETCs流式细胞染色鉴定：收集培养好的DETCs，用含2%FBS的PBS洗2次，200 μl 2% FBS的PBS重悬细胞，按1：200加入anti-CD 16/32（Clone 2.4G2）室温孵育10 min，按1：200加入PECY5-anti -γδTCR（Clone GL3）、PE-anti-CD3ε（Clone 145 -2C11）荧光抗体4℃孵育30 min。标本取出后，用含2% FBS的PBS 漂洗重悬上流失细胞仪检测。

3. Western blot检测表皮组织中IGF-1和KGF-1的含量：取目的小鼠表皮，液氮研磨成粉末，蛋白裂解液加PMSF、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制提取蛋白，用APC法测量并调整蛋白浓度，-80℃保存。配制浓缩胶及分离胶，各样品蛋白等量上样，电泳至溴酚兰刚跑出时终止。NC膜转膜100 V、90 min，3% BSA封闭2 h，按照目标蛋白分子量大小切膜并孵育抗体IGF-1和KGF-1 4℃过夜。内参选择GAPDH。TBST洗膜后孵育二抗1 h，洗膜，使用化学发光法曝光显影，使用凝胶图像处理系统分析目标带的净光密度值。

4.制作链脲霉素诱导糖尿病小鼠模型：模型分两组，实验组C57BL/6小鼠注射含100 mg/kg 链脲霉素（sigma）的生理盐水，空白组C57BL/6小鼠注射生理盐水，连续6 d。小鼠尾静脉血测血糖，每隔1 d的下午两点评估血糖值，当血糖值超过250 mg/dl当被认为糖尿病模型遭模成功，模拟糖尿病。

5.制作动物打孔模型：糖尿病小鼠用戊巴比妥钠麻醉后，背部皮肤剃毛，消毒，用消毒后的打孔器于背部正中位置制直径为0.5 cm的全层皮肤切除创面，伤后小鼠自由饮食。

6.注射DETCs于糖尿病小鼠创面：实验组取5只糖尿病小鼠，分别给糖尿病小鼠创周取4个点注射5×105个DETCs，对照组行同样方式给5只糖尿病小鼠创周注射等量PBS，分别于DETCs移植后1、2、3、4、5、6、7天观察创面愈合情况。

三、统计学分析方法

采用SPSS 11.0统计软件，创面未愈合面积采用单因素方差分析，通过图像分析软件Image-proplus分别统计每组5只糖尿病小鼠每天创面面积与红色标尺面积之比数据用± s 表示，实验组和对照组两组间均数比较采用t检验，以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、糖尿病和野生型小鼠表皮组织中DETCs比例和IGF-1/KGF-1表达情况

小鼠剃毛备皮后分别分离出糖尿病小鼠表皮细胞和野生型小鼠表皮细胞单细胞悬液，分别做PE -CY5-anti-γδTCR（Clone GL3）、PE-anti-CD3ε（Clone 145-2C11）荧光抗体染色，检测DETCs在野生型小鼠表皮中占比为5.2%～ 6.9%，同样的条件下测得DETCs在糖尿病小鼠表皮中占比为2.4%～ 3.2%，同比下降一半（图1、2），结果具有统计学差异（2.764%±0.402%vs 6.084%±0.897%，P ＜ 0.01）。结果表明对比野生型小鼠，糖尿病小鼠表皮中DETCs比例显著下降。同时通过westernblotting检测发现对比野生型小鼠，糖尿病小鼠表皮中IGF-1和KGF-1表达显著下降（图3）。

图1　流式细胞仪检测糖尿病小鼠表皮中和野生型小鼠表皮中DETCs的含量

图2　小鼠表皮中DETCs的含量

二、原代培养DETCs的形态学特征及鉴定

原代分离的C57BL/6小鼠表皮细胞通过刺激后，观察发现部分细胞在刺激后的第3天开始变大变圆，第6 ～ 7天开始出现长条形、多角形细胞经过测定即DETCs，DETCs在表皮中所占比例较少，纯化后比例也仅能达到5%～ 8%。DETCs的大量增殖一般发生在3周之后，原代培养7 d，DETCs出现一个静息状态，检测到只占总细胞的3%～ 4%，这样的状态要持续在21 d后，通过不断的对细胞进行半换液，检测到DETCs占总细胞的85%～ 90%，在35 d能检测到DETCs占总细胞的98%（图4）。

图3　western-blotting显示为糖尿病小鼠表皮中的IGF-1和KGF-1对比野生型小鼠表皮表达下降

图4　在倒置显微镜下观察DETCs培养形态 （ ×100 ）

三、培养后的DETCs多点注射到糖尿病小鼠创周观察多个时相点创面愈合情况。

获得大量高纯度DETCs后，实验组糖尿病小鼠创周注射2×106个DETCs，对照组糖尿病小鼠则创周注射等量PBS；通过图像分析软件Image-pro plus分别统计每组5只糖尿病小鼠每天创面面积与红色标尺面积之比数据统计分析，从第2天开始，实验组明显比对照组创面愈合时间加快（图5），结果具有统计学差异（表1）。

图5　观察实验组与对照组每天糖尿病创面愈合情况

表1　两组糖尿病小鼠创面愈合面积比比较情况（± s）

表1　两组糖尿病小鼠创面愈合面积比比较情况（± s）

组别例数第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天对照组50.888 ± 0.0280.769 ± 0.034 0.667 ± 0.0280.560 ± 0.0440.383 ± 0.0800.292 ± 0.0350.178 ± 0.024实验组50.839 ± 0.0270.692 ± 0.0380.492 ± 0.0460.281 ± 0.0210.161 ± 0.0280.098 ± 0.0160.011 ± 0.003 t 值3.0203.6666.84213.5206.3979.96216.660 P值 0.05＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01＜ 0.01

综合7 d糖尿病小鼠创面愈合情况，表明移植DETCs可加速糖尿病创面愈合（图5）。取第4天的实验组和对照组小鼠创周表皮做western-blotting检测到实验组IGF-1和KGF-1表达量比对照组升高（图6）。这些结果表明移植DETCs，促进了IGF-1和KGF-1的产生，从而促进角质形成细胞的增殖和迁移，促进糖尿病小鼠创面愈合。

图6　DETCs注射糖尿病小鼠创周第4天Western-Blotting

讨 论

糖尿病创面是慢性难愈性创面中重要的一类，严重危害了患者的身心健康，降低了生活质量并且增加了大量的医疗负担，使患者难以享受到正常人的生活。研究发现，慢性难愈合创面糖尿病足的发生率则由10年前的不足5%上升至36%左右，所消耗的医疗资源也明显增加［2］。慢性难愈合创面的防控，已经成为近年来国内乃至国际上治疗的一个难点，是我国疾病谱变化的一个新趋势，应当给予关注并积极应对。

目前研究表明细胞生长因子KGF-1和IGF-1在创面愈合再上皮化过程中起极其重要的作用［8］。KGF-1和IGF-1分别通过促进创面表皮细胞增殖和抑制创面表皮细胞凋亡来协同完成创面再上皮化过程［6，9］。本研究发现对比正常小鼠，糖尿病小鼠表皮组织中KGF-1和IGF-1蛋白表达水平显著降低。

γδ T细胞是表皮中主要的T细胞，也被称为DETC，与皮肤的免疫、炎症、癌变、稳态和愈合等均有密切关系［10-11］。目前研究表明DETC是表皮组织中分泌生长因子KGF-1和IGF-1最主要的细胞［12-13］。而γδ T细胞在糖尿病创面难愈中的作用尚不清楚。为了阐明DETC在糖尿病创面难愈中所扮演的角色，本研究首先检测糖尿病小鼠和正常小鼠表皮组织中DETC的比例，发现糖尿病小鼠DETCs较正常小鼠比例显著降低，进一步评价外源性给予DETCs在糖尿病小鼠创面愈合中的作用。结果表明外源性给予DETCs后，明显增加了IGF-1和KGF-1在糖尿病小鼠创面表皮中的表达水平，并显著提高了糖尿病小鼠创面愈合速度。提示糖尿病小鼠DETCs数量显著减少引起表皮组织中KGF-1和IGF-1显著下降，导致糖尿病创面再上皮化障碍及愈合延迟。

然而，DETCs在体外大量培养一直是困扰我们的难题，因为皮肤上皮组织由大量的角质形成细胞，γδT细胞，骨髓来源细胞，黑色素细胞等组成［10］。DETCs在正常表皮中的比例只占5%～ 9%（图1），而细胞治疗要求DETCs纯度达到98%以上。至此本研究经过了一个漫长的培养阶段，最终揭示出DETCs的生长规律。DETCs培养在1 ～ 3周之间表现出静息状态，流式细胞检测比例3%～ 4%，在3周以后，出现大量成倍增殖，通过不断地换液，在4周之后，DETCs的比例逐渐达到用于创面治疗所需的细胞数量和纯度。

综上所述，本研究表明DETCs减少是导致糖尿病创面难愈的主要因素之一，通过成功建立体外扩增DETCs技术为将来进一步应用DETCs治疗糖尿病难愈性创面奠定坚实基础。

1 Posnett J， Franks PJ. The burden of chronic wounds in the UK［J］. Nurs Times， 2008， 104（3）：44-45.

2 Bartus CL， Margolis DJ. Reducing the incidence of foot ulceration and amputation in diabetes［J］. Curr Diab Rep， 2004， 4（6）：413-418.

3 Spravchikov N， Sizyakov G， Gartsbein M， et al. Glucose effects on skin keratinocytes： implications for diabetes skin complications［J］. Diabetes， 2001， 50（7）：1627-1635.

4 Eming SA， Martin P， Tomic-Canic M. Wound repair and regeneration：mechanisms， signaling， and translation［J］. Sci Transl Med， 2014， 6（265）：265sr266.

5 Hayday AC， Saito H， Gillies SD， et al. Structure， organization， and somatic rearrangement of T cellγ genes［J］. Cell， 40（2）：259-269.

6 Toulon A， Breton L， Taylor KR， et al. A role for human skin-resident T cells in wound healing［J］. J Exp Med， 2009， 206（4）：743-750.

7 Sharp LL， Jameson JM， Cauvi G， et al. Dendritic epidermal T cells regulate skin homeostasis through local production of insulin-like growth factor 1［J］. Nat Immunol， 2005， 6（1）：73-79.

8 J Jameson， K Ugarte， N Chen， et al. A role for skin γδT cells in wound repair［J］. Science， 296（5568）：747-749.

9 Karvinen S， Pasonen-Seppänen S， Hyttinen JM， et al. Keratinocyte growth factor stimulates migration and hyaluronan synthesis in the epidermis by activation of keratinocyte hyaluronan synthases 2 and 3［J］. J Biol Chem， 2003， 278（49）：49495-49504.

10 Hsu YC， Li L， Fuchs E. Emerging interactions between skin stem cells and their niches［J］. Nat Med， 2014， 20（8）：847-856.

11 Girardi M， Lewis J， Glusac E， et al. Resident skin-specifi c gammadelta T cells provide local， nonredundant regulation of cutaneous infl ammation［J］. J Exp Med， 2002， 195（7）：855-867.

12 Taylor KR， Costanzo AE， Jameson JM. Dysfunctional γδ T cells contribute to impaired keratinocyte homeostasis in mouse models of obesity［J］. J Invest Dermatol， 2011， 131（12）：2409-2418.

13 Taylor KR， Mills RE， Costanzo AE， et al. Gammadelta T cells are reduced and rendered unresponsive by hyperglycemia and chronic TNFalpha in mouse models of obesity and metabolic disease［J］. PLoS One， 2010， 5（7）：e11422.

（本文编辑：蔡晓珍）

刘美希，刘中阳，李雅舒，等. DETC细胞对糖尿病小鼠创面的治疗效果［J/CD］.中华细胞与干细胞杂志：电子版， 2016，6（4）：209-214.

Topical administration of dentritic epidermal T lymohocytes on wound enhanced wound healing in diabetic mice

Liu Meixi1， Liu Zhongyang2， LiYashu1， Bai Yang1， Luo Gaoxing1， Wu Jun1， He Weifeng1.

1Chongqing Key Laboratory for Diseases Proteomics； State Key Laboratory of Trauma， Burns and Combined Injury； Institute of Burn Research， Southwest Hospital， Third Military Medical University， Chongqing 400038， China；2Department of Burns， the First Affiliated Hospital of Sun Yatsen University， Guangzhou 510080， China

He Weifeng， Email：whe761211@hotmail.com

Objective To establish culture method for dentritic epidermal T lymohocytes（DETCs）in vitro and investigate the effects of topical administration of DETCs on wound healing in diabetic mice. Methods The number of DETCs and expression of IGF-1/KGF-1 in epidermis of normal and diabetic mice were examined by means of FACS and Western Blot respectively. Wound closures of mice with PBS treatment or DETC administration were checked daily. Results Both of the ratio of DETCs and the expression of IGF-1/KGF-1 in epidermis of diabetic mice were dramatically decreased， as compared to normal control. High-purity primary DETCs were obtained by culture in vitro. Topical administration of DETCs could enhance expression of IGF-1/KGF-1 and improved wound healing in diabetic mice. Conclusion Topical administration of DETCs could significantly enhance diabetic wound healing.

Diabetes； Wound healing； T-Lymphocytes； Insulin-Like Growth Factor I

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.04.003

国家自然科学基金（81372082，81373155）；重庆市自然科学基金（cstc2015jcyja10064）

贺伟峰，Email：whe761211@hotmail.com

（2016-05-23）