脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定

肖漓 白剑 陈文 黄海燕 何秀云 韩永 许晓光 樊文梅 毕丽丽 高钰孔祥瑞 魏玉香 石炳毅

脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定

肖漓 白剑 陈文 黄海燕 何秀云 韩永 许晓光 樊文梅 毕丽丽 高钰孔祥瑞 魏玉香 石炳毅

目的 探讨脐带间充质干细胞的外泌体的获取与鉴定方法。方法 通过组织块贴壁法从胎儿脐带分离和培养脐带间充质干细胞并通过RiboTMExosome Isolation Kit收集外泌体，采用电镜和流式细胞仪鉴定外泌体。结果 第二代脐带间充质干细胞表面CD45、CD34和HLA-DR呈阴性表达，CD29、CD44和CD105呈阳性表达；在透射电镜下观察到脐带间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形，大小不均匀，直径30 ～ 100 nm，有完整的膜结构，内含低密度物质；流式细胞检测外泌体CD9、CD63、CD81和CD83呈阳性表达。结论 在培养脐带间充质干细胞的培养基中可以收集到外泌体，可以通过电镜和流式细胞仪对脐带间充质干细胞的外泌体进行鉴定。

脐带； 间质干细胞； 细胞分离； 外泌体； 生物学标记； 鉴定

脐带间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的成体干细胞。由于其来源无伦理学限制，容易获得，且增殖速度快，免疫原性低，目前已经广泛的在医疗领域用以治疗缺血性疾病、糖尿病、心血管疾病、肿瘤、移植排斥和自身免疫性疾病，而且脐带间充质干细胞在治疗疾病过程中的“免疫安全性”也得到证实［1-4］。脐带间充质干细胞生物学功能主要是通过细胞间的相互作用、分泌细胞因子和上调细胞表面的抑制分子实现的［1］。

外泌体是细胞间调节的重要介质之一，在1979年被发现，但最初被认为是细胞在发育过程中代谢的“垃圾”［5］。目前认为外泌体是由多种细胞在生理或者病理状态下分泌的直径在40 ～ 100 nm的同质性囊泡，在蔗糖密度梯度溶液中密度范围1.1 ～ 1.19 g/ml，在囊泡中含有不同类型的蛋白质、mRNA、DNA和miRNA等生物活性物质。靶细胞可以通过胞吞作用将囊泡及其内部的活性物质吞入细胞内，使这些物质在细胞内部发挥生物学功能，因此外泌体可以看做是细胞发挥生物学活性的一种载体［6］。

作者单位：100091 北京，解放军第三〇九医院全军器官移植研究所移植研究室 北京市器官移植与免疫调节重点实验室

脐带间充质干细胞的外泌体可以模拟脐带间充质干细胞的部分功能，发挥其促进组织修复和免疫调节的作用，而且外泌体不具备细胞核结构，在宿主体内不能扩增，在临床应用过程中具有较好的安全性，因此具有较好的推广价值［5］。本文从技术层面阐述了脐带间充质干细胞外泌体的分离方法，并通过流式细胞仪和透射电镜鉴定外泌体的特点，旨在为临床上获取和鉴定外泌体提供参考。

材料与方法

一、材料

足月新生儿脐带来自于中国人民解放军第三〇九医院，取得父母知情同意后，经本院伦理委员会讨论通过用以制备脐带间充质干细胞；DMEM/DF12培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；PBS溶液（美国Gibco公司）；RiboTMExosome Isolation Kit（瑞博生物科技有限公司）；CX31倒置显微镜（日本Olympus公司）；H-7650透射电镜（日本HITACHI公司）；流式细胞仪FACSCalibur；CytoFLEX流式细胞仪（德国BECKMAN公司）；单克隆抗体CD45-Percp、CD34-PE、HLA-DR-FITC、CD63-PE、CD9-FITC、CD81-PE、CD83-PE、CD29-PE、CD44-FITC、CD105-APC（美国BD公司）；磷钨酸（天津市津科精细化工研究所）；2.5%戊二醛固定液（美国leagene公司）；二氧化碳培养箱（美国Thermo Fisher公司）；0.25%胰酶、分支聚乙烯亚胺（PEI）和纳米金（美国Sigma公司）；T25培养瓶（美国Corning公司）。

二、方法

1.脐带间充质干细胞的分离培养及鉴定：按照文献［7］操作，脐带取出后置于超净工作台中，将脐带外表面用75%的酒精消毒，并用PBS反复冲洗3次。在无菌条件下，将脐带切成5 ～ 6 cm，并用注射器吸取PBS反复冲洗脐带动静脉中的残留血液，直至从脐带血管中流出的PBS澄清为止，用无菌见到从脐静脉将脐带纵行剖开，剔除动静脉，使用齿镊分离Wharton's jelly胶。

将Wharton's jelly胶用眼科剪剪碎至大小1 ～ 2 mm2的组织块，转移至50 ml的离心管中，加入PBS约30 ml，离心半径8cm，1 500 r/min离心5 min，重复洗涤1次以去除残留血液和黏稠的细胞渗出物。将第2次离心后的组织加入含10%胎牛血清的DMEM/DF12培养基中培养3 d后，半量换液。在培养到第7 d时显微镜下观察脐带间充质干细胞生长情况，如果没有出现沿组织块边缘生长的细胞，则继续半量换液，如发现在组织块周围出现贴壁生长的细胞，则可以用PBS清洗细胞碎块直至无残留，此后加入10%胎牛血清的DMEM/DF12培养基直至细胞融合度达到90%后按照1：3传代。将第二代脐带间充质干细胞进行流式细胞检测，将细胞消化后，离心半径8 cm，1 500 r/min离心5 min后弃除培养基，使用PBS清洗2次后重悬并调整细胞浓度至1×106/ml单细胞悬液，取出200 μl细胞悬液分别加入CD45-Percp、CD34-PE、HLA-DRFITC、CD29-PE、CD44-FITC、CD105-APC不同类型的流式抗体5 μl，避光室温孵育15 min后上机检测。

2.脐带间充质干细胞来源的外泌体的分离：脐带间充质干细胞常规培养，在细胞融合度达到70%后，更换培养基并连续培养10 ～ 12 h后收集上清，在室温下2 000×g离心30 min，去除细胞碎片。转移上清至2 ml离心管中。按照瑞博生物科技有限公司RiboTMExosome Isolation Kit试剂盒说明书操作。将2 ml样本移入干燥的2 ml离心管中，加入三分之一体积的RiboTMExosome Isolation试剂B，颠倒混合直至样本完全均匀溶解。将混合物放入4℃冰箱过夜后，将混合液移入新的2 ml离心管中，在1 500×g离心30 min，弃上清，管内的剩余物质即为外泌体。

3.电镜检测脐带间充质干细胞外泌体：将2 ml PBS加入分离外泌体的离心管中混匀，按照1：50倍稀释后取外泌体稀释液10 μl，滴加于2 mm的含碳载样铜网上，在室温下静置5 min后用滤纸将多余液体轻轻吸去，用3%（w /v）磷钨酸钠溶，后室温晾干，用透射电子显微镜观察并照相。

4.流式细胞仪检测外泌体生物标志物：检测第2步脐带间充质干细胞培养的外泌体，单独加入CD63-PE /CD9-FITC/CD81-PE /CD83-PE不同类型的流式抗体5 μl，避光室温孵育15 min。由于外泌体的粒径太小，很难用普通流式检测，之后本研究采用纳米金颗粒增加外泌体的粒径，方法如下：染色后的外泌体溶液加入PEI，37℃孵育15 min，之后超速离心去除PEI。加入金纳米颗粒，轻柔重悬后置于培养箱中60 min，加入APC-DNA染料，室温孵育15 min后流式检测。APC阳性的颗粒即为所需要检测的外泌体。

结 果

一、脐带间充质干细胞的表面分子的鉴定

将第二代脐带间充质干细胞进行流式细胞检测，CD45、CD34和HLA-DR呈阴性表达，CD29、CD44和CD105呈阳性表达（图1）。

图1　间充质干细胞的表面分子表达

二、脐带间充质干细胞外泌体的电镜检测结果

在透射电镜下观察到脐带间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形，大小不均匀，直径约30 ～100 nm，有完整的膜结构，内含低密度物质（图2）。

图2　脐带间充质干细胞外泌体电镜图

三、脐带间充质干细胞外泌体表面分子的鉴定

将第二代脐带间充质干细胞外泌体CD9、CD63、CD81和CD83呈阳性表达（图3）。在透射电镜下观察到脐带间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形，大小不均匀，直径约30 ～ 100 nm，有完整的膜结构，内含低密度物质。

图3　脐带间充质干细胞外泌体标志物CD9、CD63、CD81和CD83呈阳性表达

讨 论

由于脐带间充质干细胞的来源无伦理学限制，增殖速度快，容易实现产业化，是目前最具前景的间充质干细胞之一［1，8］。有研究报道，脐带间充质干细胞可以用来治疗多种疾病。可以停留在靶器官如肝、脾和肾内，对于治疗器官移植排斥反应、缺血性疾病以及肿瘤具有较好的作用［3，9-10］。但在靶器官内的停留时间有限，一般在几天内消失，只有少量脐带间充质干细胞可以长期停留，仍然具有对组织损伤的修复功能，基因图谱技术显示再生的细胞来自于模型中存活的固有细胞。上述提示，脐带间充质干细胞的某些生物学特征不是自身增殖形成，而是通过内分泌和旁分泌的活性物质实现。

有研究显示，脐带间充质干细胞具有强大产生外泌体的能力，其外泌体产生是通过核内体途径实现的，首先在胞浆内形成初级核内体，经过包裹部分胞浆内成分后形成次级核内体（多泡体），最后经过召集并与衔接蛋白Alix连接发育成熟，与质膜结合后释放到周围环境中［1］。因此，脐带间充质干细胞的外泌体膜与细胞膜相似，也具有脂质双分子层结构，其中包裹了大量的具有活性蛋白质、DNA、mRNA和miRNA，具有脐带间充质干细胞的部分生物学功能。但脐带间充质干细胞的外泌体在发育成熟的过程中，可以形成自身特有的跨膜蛋白和融合蛋白，其中部分跨膜蛋白在外泌体的外膜上形成了特异性的细胞标志，包括Alix、CD9、CD63、CD81和CD82，可以把这些跨膜蛋白作为鉴定标记。目前，用以检测外泌体的技术很多，包括流式细胞术、阻抗式流式细胞仪、原子显微镜、电子显微镜、动态光散射技术和生物免疫技术等［11-12］。但上述技术都具有其局限性：原子显微镜和电子显微镜可以检测的精度高，能够检测到非常小的颗粒，但是方法繁琐，需要有专业技术人员协助，检测速度慢，不适合高通量检测，而且费用高昂；动态光散射技术可以检测到很小的颗粒，但是特异性较差，对样本的数量和大小估算不准确，对与大小不均匀的样本检测误差大；生物免疫技术适合高通量的筛选，操作方法简单，但是无法有效的检查颗粒的大小和形状，特别是对样本的需求量较大，提纯样本的费用高昂；流式细胞仪检测的速度快，适合高通量筛选，而且可以分析颗粒的大小和体积，适合检测使用。由于外泌体的颗粒度较小，一般认为直径在30 ～ 100 nm之间，而普通的流式细胞仪主要以检测细胞为主，检测颗粒的直径在300 ～ 500 nm之间，采用普通流式细胞仪无法有效的区分出细胞颗粒的直径和背景噪音，因此本次试验采用了CytoFLEX流式细胞仪，这种细胞仪属于超灵敏细胞仪，可以检测到较小的粒径。为了验证流式细胞的检测结果，本研究采取精确度较高的电镜技术，从多个角度证实了外泌体的存在及使用流式细胞鉴定外泌体的可行性。

综上所述，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质、DNA、mRNA和miRNA，并且外泌体作为细胞信号的交流载体，其作用渐渐为人们所重视［13-14］。外泌体是由细胞分泌的，可以行使部分细胞功能，而且他没有细胞核的结构，在体内的安全性优于细胞疗法，同时他还能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故外泌体有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体，在临床治疗中发挥作用。

1 张娟， 史晋叔， 李剑. 间充质干细胞源性外泌体——未来生物疗法的理想载体［J］. 中国实验血液学杂志， 2015， 23（4）：1179-1183.

2 赵钦军， 任红英， 韩忠朝. 间充质干细胞的来源及其对肝脏损伤及修复的研究进展［J/CD］. 中华细胞与干细胞杂志：电子版， 2014，4（4）：32-41.

3 马锡慧， 肖漓， 石炳毅. 间充质干细胞免疫抑制作用及其在移植免疫中应用的研究进展［J/CD］. 中华细胞与干细胞杂志：电子版， 2015，5（1）：42-47.

4 徐燕， 李长虹， 孟恒星， 等. 人脐带间充质干细胞分离培养条件的优化及其生物学特性［J］. 中国组织工程研究与临床康复， 2009，13（32）：6289-6294.

5 马锡慧， 冯凯， 石炳毅. 人脐带间充质干细胞生物学特性及其研究进展［J］. 中国组织工程研究与临床康复， 2011， 15（32）：6064-6067.

6 冯影， 卢士红， 王昕， 等. 人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体特性研究［J］. 中国实验血液学杂志， 2014， 22（3）：595-599.

7 马锡慧， 肖漓， 冯凯， 等. 人脐带和骨髓间充质干细胞体外分离培养及生物学特性比较［J/CD］. 中华细胞与干细胞杂志：电子版， 2015，5（2）：10-13.

8 杨大志， 易伟宏. 人脐带间充质干细胞多向分化能力的研究和应用进展［J］. 湖北医药学院学报， 2015 （3）：313-318.

9 赵钦军， 任红英， 韩忠朝. 间充质干细胞的来源及其对肝脏损伤及修复的研究进展［J/CD］. 中华细胞与干细胞杂志：电子版， 2014，4（4）：32-41.

10 张立， 王强. 间充质干细胞在皮肤损伤修复中的作用研究［J］. 中国临床医学， 2015 （4）：571-574.

11 胡国文， 李青， 牛鑫， 等. 旋转超滤：一种提取细胞外泌体的新方法［J］.第二军医大学学报， 2014， 35（6）：598-602.

12 Kim J， Tan Z， Lubman DM. Exosome enrichment of human serum using multiple cycles of centrifugation［J］. Electrophoresis， 2015，36（17）：2017-2026.

13 Im H， Shao H， Weissleder R， et al. Nano-plasmonic exosome diagnostics［J］. Expert Rev Mol Diagn， 2015， 15（6）：725-733.

14 Zhang J， Li S， Li L， et al. Exosome and exosomal microRNA：trafficking， sorting， and function［J］. Genomics Proteomics Bioinformatics， 2015， 13（1）：17-24.

（本文编辑：蔡晓珍）

肖漓，白剑，陈文，等. 脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定［J/CD］.中华细胞与干细胞杂志：电子版， 2016，6（4）：236-239.

Isolation and identification of exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal

stem cells Xiao Li， Bai Jian， Chen Wen， Huang Haiyan， He Xiuyun， Han Yong， Xu Xiaoguang，Fan Wenmei， Bi Lili， Gao Yu， Kong Xiangrui， Wei Yuxiang， Shi Bingyi

Beijing Key Laboratory of Immunology Regulatory and Organ Transplantation， Basic Research Laboratory of Organ Transplant Institue， 309th Hospital of Chinese People's Liberation Army， Beijing 100091， China

Shi Bingyi， Email：shibingyi@medmail.com.cn

Objective Exosomes of hUC-MSCs（human umbilical cord mesenchymal stem cells）were harvested and identified. Methods hUC-MSCs were isolated and cultured from fetal umbilical cord. Exosomes of hUC-MSCs were harvested by RiboTM Exosome Isolation Kit and identified by transmission electron microscopy and flow cytometry. Result hUC-MSCs of second passage expressed CD29， CD44 and CD105 and did not express CD45， CD34 and HLA - DR. Exosomes of hUC-MSCs were circular or elliptic， irregular， with a diameter of about 30 ～ 100 nm . Exosomes of hUC-MSCs have a complete membrane with low density content under transmission electron microscopy. Flow cytometry showed exosomes of hUC-MSCs expressed CD9， CD63， CD81 and CD83. Conclusion Exosomes of hUC-MSCs can be found in the supernatant of hUC-MSCs，and it can be identified by transmission electron microscopy and flow cytometry.

Umbilical cord； Mesenchymal stem cells； Cell Separation； Exosome；Biomarker； Identification

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.04.007

国家自然科学基金（81571555）；解放军第三〇九医院重点课题（2015-ZD002）

石炳毅，Email：shibingyi@medmail.com.cn

（2016-05-23）