颈动脉与鞘内注射脐带血干细胞治疗一氧化碳中毒迟发性脑病的临床研究

王焕君 李严 吴强 徐成龙 刘庆冉 张晓风 田蕊

颈动脉与鞘内注射脐带血干细胞治疗一氧化碳中毒迟发性脑病的临床研究

王焕君 李严 吴强 徐成龙 刘庆冉 张晓风 田蕊

目的 观察脐带血干细胞蛛网膜下腔及颈动脉注射治疗一氧化碳中毒迟发性脑病（DEACMP）的安全性及治疗效果。方法 收集沧州市中心医院2012年10月至2015年9月期间因DEACMP入院治疗的患者32例，设立治疗组：对17例DEACMP患者以颈动脉及鞘内进行间充质干细胞（MSC）注射，每次注射MSC为2×107，每次间隔7 d，注射4次为1疗程并在治疗前和治疗后与对照组进行影像学和症状体征，治疗副作用及智能精神状态评分（MMSE）和日常生活活动能力（Barthl）评分；对照组：仅给予常规改善脑代谢药物胞二磷胆碱等及维生素类药物治疗。对2个组不能进食者予以补液治疗。各组数据使用重复测量资料的方差分析对结果进行统计分析。结果 所有患者在干细胞治疗中均无特殊不适，均未出现治疗不良反应。治疗组患者MMSE评分为94.35 ± 12.56，高于对照组3.24 ± 2.32（t =27.6288，P = 0.000）；治疗组Barthl评分为93.60 ± 13.36，高于对照组6.39 ± 6.80，差异均有统计学意义（t = 22.3845，P = 0.000）。治疗组影像检查结果好转率为76.47%，对照组好转率为 26.66%两组比较差异有统计学意义（χ2= 4.402， P = 0.0359）。结论 MSC颈动脉与鞘内注射治疗DEACMP效果显著。

一氧化碳中毒； 迟发型脑病； 脐血干细胞移植

一氧化碳中毒是常见病、多发病，一氧化碳（CO）中毒后迟发性脑病（delayedencephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP）是指约有10%～ 30%的一氧化碳中毒患者经抢救在急性中毒症状恢复后，经过数天或数周表现正常或接近正常的“假愈期”平均（23.80 ± 14.00）d后，再次出现以急性痴呆为主的一组神经精神症状。或者部分急性一氧化碳中毒（acutecarbon monoxide poisoning，ACMP）患者在急性期意识障碍恢复正常后，经过一段时间的“假愈期”，突然出现以痴呆、精神异常和锥体外系表现及二便失禁的脑功能障碍症状［1］。一般发生在急性中毒后的1 ～ 2个月内。部分患者可能出现严重的后遗症，意识障碍，或出现植物状态。以往采用高压氧疗法，脑保护剂及对症治疗，疗效欠佳，重症者，表现智能障碍，精神异常，最终导致死亡［2］。因此探索新的有效的治疗方法，对于改善DEACMP患者的预后至关重要。

干细胞是一类具有分裂潜能和自我更新能力的细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞，以取代受损的细胞和组织［3］。我院应用间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）移植治疗DEACMP 32例，疗效显著，现报告如下。

资料与方法

一、临床资料

1.一般情况：对2012年10月至2015年9月期间沧州市中心医院治疗的DEACMP患者32例，其中男18例，女14例。年龄在33 ～ 78岁，中位年龄56岁。各组患者均有明确煤气泄漏ACMP史。中毒后昏迷时间（3.0 ± 2.10）h，清醒后距DEACMP发病时间（假愈期）（25 ± 15）d；并且伴有中毒后的精神神经症状及影像学表现。

2.入组标准：（1）有CO中毒史；（2）具有“假愈期”：CO中毒患者经抢救在急性中毒症状恢复后，经过数天或数周表现正常或接近正常的时期后，再次出现以急性痴呆为主的神经精神症状；（3）临床表现：均在“假愈期”后突然起病，表现为痴呆、精神智能障碍或去大脑皮层状态及锥体外系症状，起病症状多为发呆、缄默、表情淡漠、记忆力下降，语无伦次、易激惹及二便失禁［4-5］；（4）影像资料：头颅CT检查，表现为双侧额叶白质、双侧苍白球、豆状核及内囊膝部对称或不对称性片状低密度影，边缘模糊［6］。或MRI检查，表现为脑室周围白质和半卵圆中心双侧对称的点状、斑片状或融合性病灶，T2加权呈高信号，T1加权呈低信号，基底节或苍白球区呈慢性缺血性改变［7］。

3.排除标准为：（1）严重过敏史；（2）休克；（3）全身感染或严重局部感染；（4）主要脏器功能不全；（5）凝血障碍；（6）血清抗体阳性艾滋病、乙型肝炎、梅毒；（7）遗传性疾病，（8）脑血管病性及其它神经系统疾病所致脑病；（9）部分老年患者（大于65岁）患有高血压病史、糖尿病史、急性脑血管病、慢性中枢神经系统疾病。该研究经由我院伦理委员会批准，对入组病例，常规术前检查，签署治疗知情同意书。

4.主要试剂及仪器：（1）主要试剂：人脐血干细胞（来自于健康胎儿）、间充质培养基（biowit BW110013）、鼠抗人抗体：CD106-PE、CD45-PE、CD34-PE、CD29-FITC、CD44-FITC、CD-14-PE、CD31-PE、HL-DR-FITC（美国BD公司）；（2）主要仪器：离心机（thermo）、流式细胞仪（Beckman，America）自制穿刺套管针（获国家专利［14］专利号ZL00 2 06719.6）、CT（日本东芝64排螺旋CT）。

二、研究方法：

1.分组：将入组的DEACMP患者随机分为2组：治疗组：17例，男9例，女8例；中位年龄56岁，其中33 ～ 50岁4例，50 ～ 59岁6例，59 ～ 69岁3例，70以上岁4例；对照组：15例，男9例，女6例；中位年龄56岁，其中33 ～ 50岁4例，50 ～ 59岁5例，59 ～ 69岁4例，70岁以上2例。两组患者年龄、CO中毒情况、昏迷时间、平均假愈期、发病情况及智能精神状态评分（Mini-Mental State Examination，MMSE）［8-9］、日常生活活动能力评分（Barthl）［8，10］具有可比性缄默（表1）。

2.干细胞的培养、鉴定：干细胞来源健康胎儿脐带；培养扩增方法：无菌取健康胎儿脐带8 ～10 cm，生理盐水充分洗涤，分离并且去除脐带外膜组织和脐静脉及脐动脉，即可获得人脐带华通氏胶组织，将其剪碎1 mm3组织块，加入30 ml 0.9%氯化钠溶液洗涤，室温626×g离心5min，取上清液，重复洗涤1次，加入配好的间充质培养基30 ml，取T75培养瓶，按照每瓶0.5华通氏胶的份量，将30 ml混悬液体平均分装于T75培养瓶中，平铺覆盖于瓶底。在培养瓶上记录日期后，放入CO2培养箱中，3 d后观察颜色，查看是否存在污染的可能，如无污染5 ～ 6 d后进行第1次换液。培养10 d左右根据细胞生长情况进行细胞传代，MSC传入3代后进行细胞冻存［11-12］。干细胞的鉴定、纯化：（1）采用流式细胞仪进行鉴定：细胞复苏后扩增培养一代，取第四代细胞，用质量分数为0.25%胰酶消化后，生理盐水洗涤3次，调整细胞（1.0 ～ 2.0）× 106个细胞/ml，分为每管0.1 ml。阴性对照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE；其它管分别加入鼠抗人抗体CD106-PE、CD45-PE、CD34-PE、CD29-FITC、CD44-FITC、CD-14-PE、CD31-PE、HL-DR-FITC，室温孵育30 min，流式细胞仪计数5 000 ～ 10 000个细胞［13］。流式细胞仪鉴定发现：MSC表面标志CD44、CD73、CD90表达阳性率均达90%以上，不表达造血干细胞的表面标志CD34、CD45等。

表1　二个组DEACMP患者干细胞治疗前基本情况

3.治疗方法：（1）治疗组：选择蛛网膜下腔（鞘内）注射及颈动脉加压注射（采用自制穿刺套管针，获国家专利［14］专利号ZL00 2 06719.6）交替进行，对首次效果不佳者也可鞘内与颈动脉同时进行，每次注射间隔时间为7 d，每次注射MSC为2×107个，注射4次为1疗程，颈动脉注射6例，均注射4次；鞘内注射5例，均注射4次：颈动脉与鞘内联合注射6例，注射2次。（2）对照组：给予静输改善脑细胞代谢，二磷胆碱等药物及维生素类联合高压氧对症治疗。两组不能进食者予以补液治疗，合并脑水肿者给与脱水降颅压治疗。

4.疗效评价标准：二个组分别于治疗前及治疗后1、3、6个月进行MMSE评分及Barthl评分（根据评分高低来评估量化患者治疗前后症状体征变化）及治疗前后影像改变情况分析。

二个组患者治疗前及治疗后6个月影像表现分型标准［15-16］：（1）CT分型：轻度异常：仅有两侧或一侧基底节低密度改变以及累及苍白球为主；中、重度异常：表现皮层下广泛的、程度不等的脑白质低密度改变、双侧额叶白质、双侧苍白球、豆状核及内囊膝部对称或不对称性片状低密度影，边缘模糊；（2）MR分型：轻度异常：两侧苍白球长T1、长T2卵圆形异常信号；中重度异常：表现为脑室周围白质和半卵圆中心双侧对称的点状、斑片状或融合性病灶，T2加权呈高信号，T1加权呈低信号，基底节或苍白球区呈慢性缺血性改变。

三、统计学分析方法

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行处理，两组患者的年龄、昏迷时间、假愈期、MMSE评分分值、Barthl评分分值用 x ± s 表示，其中两组患者组间MMSE评分分值、Barthl评分分值的比较采用t 检验，组内不同时间评分分值比较用重测量资料方差分析，临床疗效及影像评定结果比较采用卡方检验，以P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、治疗效果评分

采用MMSE及Barthl评分，两组分别于治疗前及治疗后1、3、6个月评分，干细胞组较对照组差异具有统计学意义（P ＜ 0.01，表2、3）。

表2　二组DEACMP患者治疗前后MMSE评分（分）

表3　二组DEACMP患者治疗前后Barthl评分（分）

二、治疗前后影像表现

两组病例中有25例行头颅CT（日本东芝64排螺旋CT）检查，17例行头MRI（美国GE公司3.0T磁共振成像系统）检查。治疗后行头颅CT检查，治疗前后患者影像表现改变。（表4）

表4　二组DEACMP患者治疗前及治疗后6个月影像表现比较

三、治疗后症状体征改善情况

两组患者经治疗后治疗组临床症状明显好转，无意识障碍、智能障碍、去皮层状态等；而对照组患者不仅仅存在智能障碍去皮层状态及植物状态（表5）。

表5　二个组DEACMP患者治疗前后症状体征变化比较［例（%）］

四、治疗安全性观察

应用干细胞及治疗的时的患者，有4例鞘内注射患者有低烧外，另有3例鞘内注射患者腰骶部胀痛感，令其增加卧床时间症状改善；其它注射患者无任何不适；穿刺部位无出血及感染等其它副作用发生。

讨 论

CO中毒迟发性脑病的发病机制目前尚不清楚，研究发现可能与缺血缺氧、细胞毒性损伤、再灌注损伤、免疫功能异常和神经递质紊乱、NO和CO信使功能失调等有关［17］发病机制的学说主要有中毒后CO大量生成、氧自由基损伤、细胞凋亡和免疫炎症反应等。另外CO进入体内，迅速与血红蛋白结合形成碳氧血红蛋白（COHb），CO与血红蛋白的结合能力是氧的300倍，但解离速度比氧慢3 600倍，极易使血红蛋白失去携氧能力，造成组织缺氧，CO还可以与还原型细胞色素氧化酶的二价铁结合，加重了组织缺氧，即使COHb恢复正常水平，细胞间残留的CO也可通过对线粒体的抑制发挥毒性作用，导致迟发性神经症状，CO中毒后导致的间断缺氧，会在脑中引起与再灌注类似的病理改变，再灌注过程中产生大量自由基，使细胞膜脂质氧化反应增强，引起线粒体功能障碍，同时，此过程中钙离子超载，可促进膜磷脂水解细胞膜，使细胞器受损，导致细胞的不可逆损伤［18］。DEACMP虽经高压氧、促进脑代谢药物及自由基清除剂等都无确切疗效［19-22］，本研究应用MSC颈动脉与鞘内注射治疗DEACMP疗效显著。

干细胞是一种未分化细胞，具有自我更新和多向分化的能力，它经过体外定向诱导或在机体的微环境诱导下可分化成特定组织细胞，从而可以达到治疗疾病的目的。实验证明MSC在一定条件下可以诱导分化为神经元或神经胶质细胞，作用机制是：（1）可以定位包绕在病变组织的周围，并形成网络修复坏损的神经组织，使患者能够恢复丧失的神经功能［18］；（2）间充质干细胞在中枢神经系统微环境下能分泌脑源性神经营养因子、碱性成纤维生长因子等营养因子，刺激损伤部位产生内源性因子，促进损伤组织的修复并减少细胞凋亡；（3）移植入脑后，能形成表达神经标志性蛋白的神经元样细胞或星形胶质细胞，产生的细胞可在受损部位周围存活甚至移行至全脑［23］；（4）MSC可分化成血管内皮细胞和细胞外基质，帮助神经保护、促进血管发生［20］；（5）间充质干细胞可以分泌多种神经营养因子以营养激活内源性神经干细胞，并诱导分化成神经组织细胞替代缺损细胞，即启动内源性途径修复损伤；（6）在脑内创造适宜的局部微环境，通过体外扩增或不同因子诱导分化的方式，使脐血干细胞分化为神经细胞后进行移植，替代受损细胞重建神经功能区和传导通路［24］。目前对于DEACMP的治疗，主要是针对已损伤但仍存活的脑细胞营养保护及功能修复来缓解患者的症状。但是对于神经元大量坏死、凋亡，脱髓鞘严重的DEACMP患者，仅靠现存活的神经细胞功能不能恢复其受损的神经功能，减轻患者的病情。本研究采用MSC鞘内与颈动脉交替注射，干细胞通过蛛网膜下腔和通过内导管直接进入颈内动脉内，使干细胞与受损脑组织有充分的接触体积，增加干细胞与病灶的接触量，颈动脉注射的MSC透过血脑屏障，并散布于脑实质的机制仍不是很清楚。目前文献报道，可能存在一种特殊的转运方式，即局部的微血管系统表达某种黏附分子［25］，并吸附MSC和介导其穿过血脑屏障。从而修复神经功能，改善患者神经精神症状，以达到治疗该病的目的。

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（本文编辑：李少婷）

王焕君，李严，吴强，等. 颈动脉与鞘内注射脐带血干细胞治疗一氧化碳中毒迟发性脑病临床研究［J/CD］.中华细胞与干细胞杂志：电子版， 2016， 6（4）：204-208.

Efficacy of carotid and intrathecal injection of umbilical cord blood stem cell in the treatment of delayed encephalopathy after carbon monoxide poisoning

Wang Huanjun， Li Yan， Wu Qiang， XuChenglong， Liu Qingran， Zhang Xiaofeng， Tian Rui.

The Sixth Department of Neurology， Cangzhou Central Hospital， Hebei Province， Cangzhou 061010， China

Wang Huanjun， Email：15303174999@189.cn

The Sixth Department of Neurology， Cangzhou

Objective To observe the safety and therapeutic effect of injection of umbilical cord blood stem cell in subarachnoid space and carotid artery in the treatment of delayed encephalopathy after carbon monoxide poisoning （DEACMP）. Methods From October 2012 to September 2015， patients with DEACMP （n = 32） admitted to our hospital were enrolled and were divided into the treatment group （n = 17） and the control group （n = 15）. Patients in the treatment group7cells weekly for 4 weeks）. Patients in the control group were given medicines for improving cerebral metabolism （Cytidine Diphosphate Choline， etc.） and vitamins. The imaging characteristics， signs and symptoms， side effects of treatment， MMSE scores and Barthl scores were compared between the treatment group and the control group before and after treatment. Patients who could not take food vs 26.66%， χ2= 4.402， P = 0.0359）. Conclusion The carotid and intrathecal injection of MSCs had significantly improved effects on the treatment of DEACMP.

parenteral nutrition in both groups. Data were expressed as mean ± standard deviation and SPSS13 was used for statistical analysis. ANOVA was used to determine statistical significance between treatments. A value of P ＜ 0.05 was considered significant. Results Patients receiving MSCs treatment had no special discomfort or adverse drug reactions. The MMSE and Barthl scores in the treatment group were significantly higher than those in the control group （MMSE： 94.35 ± 12.56 vs 3.24 ± 2.32， t = 27.6288， P = 0.000； Barthl： 93.60 ± 13.36 vs 6.39 ± 6.80， t = 22.3845， P = 0.000）. More patients in the in the treatment group recovered compared with the control group as indicated by imaging（76.47%

carotid and intrathecal injection of MSCs （2×10

作者单位：061010 沧州，河北省沧州市中心医院神经内六科

Carbon monoxide poisoning； Delayed encephalopathy； Cord blood stem cell transplantation

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.04.002

王焕君，Email： 15303174999@189.cn

（2015-10-08）