密码子优化及透明颤菌血红蛋白共表达提高耐热脂肪酶在毕赤酵母的表达

王建荣，刘丹妮，夏　雨，杨　玲，刘金山，唐　业，陈丽芝，黄佳乐，李阳源*

（广东溢多利生物科技股份有限公司，广东 珠海 519060）

密码子优化及透明颤菌血红蛋白共表达提高耐热脂肪酶在毕赤酵母的表达

王建荣，刘丹妮，夏雨，杨玲，刘金山，唐业，陈丽芝，黄佳乐，李阳源*

（广东溢多利生物科技股份有限公司，广东 珠海 519060）

根据毕赤酵母密码子的偏好性，通过在线软件对Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tll）和透明颤菌血红蛋白基因（vhb）进行密码子优化。优化后的脂肪酶基因（tll-opt）和透明颤菌血红蛋白基因（vhb-opt）中碱基GC含量分别由原来的46%提高到49%和42%提高到51%，碱基A、T、C、G均匀分布，减少了AT和GC富集区，利于tll-opt和vhb-opt基因在毕赤酵母X33中的表达。将tll和tll-opt连接到表达载体pPICZαA并转入毕赤酵母X33中。摇瓶培养条件下，含有tll和tll-opt重组工程菌的最大酶活力分别为7 U/mL和16 U/mL。50 L发酵罐培养条件下，含有tll和tll-opt重组工程菌的最大酶活力分别为201 U/mL和430 U/mL。为了进一步提高含tll-opt重组工程菌的表达酶活性，将vhb-opt转入该重组工程菌得到工程菌VHb+（含有tll-opt和vhb-opt）。重组工程菌VHb+在摇瓶培养条件下最大酶活力为23 U/mL，分别是优化后基因和原始基因最大表达酶活力的1.39 倍和3.28倍。重组工程菌VHb+在50 L发酵罐瓶培养条件下最大酶活力为610 U/mL，分别是优化后基因和原始基因最大表达酶活力的1.41 倍和3.03 倍。

密码子优化；脂肪酶；透明颤菌血红蛋白；高密度发酵

脂肪酶在油水界面上可催化天然底物油脂水解，在非水相体系中又可催化转酯和酯合成等多种反应，由于其特殊的酶学性质使其广泛地用于不同的工业领域［1-3］。随着不同工业领域的发展，每个工业领域针对自身的特点对脂肪酶的需求也各不相同，其中脂肪酶的耐温性是许多工业领域评价脂肪酶的一个重要指标。迄今报道的脂肪酶大部分耐热性较差，如来源于华根霉、米根霉、少根根霉、扩展青霉和黑曲霉等微生物的脂肪酶在65 ℃水浴处理30 min后，剩余酶活力基本为零［4-8］。相对于上述微生物脂肪酶，嗜热真菌Thermomyces lanuginosus分泌的脂肪酶均具有很好的耐热性。研究表明Thermomyces lanuginosus分泌两种耐热脂肪酶分别命名为LN和LGY。相对于LGY，LN具有更好的耐热性，在80 ℃和90 ℃分别水浴处理30 min和18 min后，剩余酶活力分别为52%和51%［9］。嗜热真菌Thermomyces lanuginosus培养操作复杂并且产脂肪酶活力低，为了提高脂肪酶LN的产量，在之前的研究中将脂肪酶LN在毕赤酵母进行异源表达［10］。

毕赤酵母作为一种成熟的真核表达系统，具有许多优点：遗传操作简单、易于培养、具有完整的蛋白加工系统并且很少分泌自身内源蛋白等［11-13］。为了进一步提高异源蛋白在毕赤酵母的表达量，科研工作者发明了许多方法，如变表达载体的启动子及信号肽，提高基因在重组酵母的拷贝数，共表达辅助蛋白、密码子优化，优化发酵条件等［14-17］。密码子优化能有效提高异源蛋白在毕赤酵母的表达量：编码异源蛋白的基因中存在许多低频密码子，这些低频密码子大大降低了异源蛋白的转录和翻译，通过优化编码异源蛋白基因的密码子可提高其在毕赤酵母的表达水平［18-20］。共表达透明颤菌血红蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）也是一种有效提高异源蛋白在毕赤酵母表达量的方法。VHb可以提高细胞活性从而使菌体细胞生物量及酶活力得到提高［21-22］。

为了提高耐热脂肪酶LN在毕赤酵母的表达，在本研究中结合了密码子优化和共表达VHb两种方法，为耐热脂肪酶LN在毕赤酵母的高效表达提供参考。

1　材料与方法

1.1试剂与培养基

博莱霉素（Zeocin） 美国Invitrogen公司；高保真Q5酶、T4 DNA连接酶 北京NEB公司；限制性内切酶EcoRI和NotI、克隆载体T-Vector pMD20 宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）纯化试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；橄榄油 益海嘉里投资有限公司；引物由苏州金维智公司合成；表达载体pPICZαA-tll、大肠杆菌top10 广东省饲料添加剂生物工程技术研究开发中心；毕赤酵母X33以及表达载体pPICZαA 美国Invitrogen公司；蛋白测定试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

大肠杆菌用LB液体及LBZ固体培养基进行培养。毕赤酵母转化子用固体YPDZ、YPDG培养基进行筛选。转化子筛选以及摇瓶培养所用的培养基分别为BMGY和BMMY。酵母高密度发酵培养为BSM培养基。LB、LBZ、YPDZ、YPDG、BMMY、BMGY和BSM培养基分别参照Invitrogen公司的酵母指导手册进行配制。

1.2方法

1.2.1密码子分析及优化

通过在线软件SignalP 4.0 server（http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/）对Thermomyces lanuginosus脂肪酶进行信号肽预测。针对毕赤酵母表达系统，通过在线软件Graphical Codon Usage Analyser（http://gcua.schoedl. de/）对不含信号肽的Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tll，GenBank登录号EU004196）和透明颤菌血红蛋白基因（vhb，GenBank登录号AY278220）的密码子进行分析，找出低频密码子。根据找出的低频密码子通过软件DNA2.0 software（http://www.dna20.com）对tll和vhb进行优化。优化后的Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tll-opt）和透明颤菌血红蛋白基因（vhb-opt）由苏州金维智公司进行合成。

1.2.2表达载体构建

优化后的Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tll-opt）用EcoRI和XbaI进行酶切并和pPICZαA进行连接，得到表达载体pPICZαA-tll-opt。将合成的透明颤菌血红蛋白基因（vhb-opt）用EcoRI和NotI进行酶切和pPIC3.5K进行连接，得到表达载体pPIC3.5K-vhb-opt。

1.2.3密码子优化提高Thermomyces lanuginosus脂肪酶在毕赤酵母的表达

将表达载体pPICZαA-tll和pPICZαA-tll-opt线性化，转化至毕赤酵母X33。高酶活转化子的筛选参照本实验室之前报道的方法并做一些改进，将转化子分别接入含有1.4 mL BMGY的24 孔板中，30 ℃培养36 h后，按1%的比例加入甲醇进行诱导培养，每24 h取样进行测定。脂肪酶活力测定以4-硝基苯基辛酸酯（p-nitrophenyl caprylate，pNPC）为底物，先加入100 μL pH 7.5的磷酸盐缓冲液，然后分别加入10 μL底物和10 μL稀释好的酶液，反应5 min后加入100 μL 2%的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液终止反应，最后在405 nm波长处测定光密度（OD）值，根据OD405nm值计算酶活力。空白对照先加2%的SDS溶液，其他反应步骤相同。通过分析测定，筛选到4 个高酶活力转化子，两个含有tll-opt基因（命名为X33/tll-opt-1和X33/tll-opt-2），另外两个含有tll基因（命名为X33/tll-1和X33/tll-2）。为了进一步比较筛选出来的高酶活力转化子，将培养条件扩大到摇瓶培养，摇瓶培养条件参照之前报道的方法进行［23-24］。经过筛选最终确定重组工程菌X33/tll-opt-2和X33/tll-1作为下一步实验的出发菌株。

1.2.4透明颤菌血红蛋白共表达

以1.2.3节方法筛选出来的高酶活转化子X33/tll-opt-2为感受态，将pPIC3.5K-vhb-opt和pPIC3.5K表达载体线性化后转入X33/tll-opt-2，转化子均匀涂布于YPDG平板，参照方法1.2.3节对YPDG平板上的转化子进行筛选，得到两株工程菌命名为VHb+（X33/tll-opt-2含有vhb-opt基因）和VHb-（不含有vhb-opt基因）。为了进一步比较筛选出来的高酶活力转化子，将重组工程菌VHb+、VHb-和X33/tll-opt-2在摇瓶条件下进行诱导培养。每24 h取样测定菌体湿质量、酶活力。

1.2.5重组酵母工程菌的高密度发酵培养

将重组工程菌X33/tll-opt-2、X33/tll-1、VHb+和VHb-在50 L发酵罐进行高密度发酵培养。重组菌的高密度发酵培养参照广东省生物技术工程中心基因发酵工程研究部之前报道的方法进行。将单菌落的重组酵母工程菌接入含有50 mL YPD培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、250 r/min振荡过夜培养。再将过夜培养的重组酵母工程菌按体积分数1%的接种量接入含有100 mL YPD培养基的500 mL三角瓶中，30 ℃、250 r/min振荡过夜培养，至OD600nm值大于10。将二次过夜培养的重组酵母工程菌按体积分数10%的接种量接入含有20 L BSM培养基的50 L发酵罐。重组酵母工程菌在50 L发酵罐的培养条件为：温度30 ℃、pH 5.0、搅拌速率500 r/min、空气流量40 L/min。培养初期，以甘油作为碳源供菌体生长。当菌体湿质量达到一定的量，停止流加甘油，待甘油被菌体吸收完后（溶氧迅速上升）开始用甲醇诱导。甲醇的添加量根据溶氧进行调整。培养过程中，每24 h取样测定菌体湿质量、酶活力、总蛋白含量。

1.2.6指标测定

摇瓶和50 L发酵罐培养条件下，脂肪酶活力测定参照GB/T 23535—2009《脂肪酶制剂》进行。细胞生物量、总蛋白含量和细胞活性的测定参照之前报道的方法进行［21-22］。细胞生物量的测定如下：量取10 mL发酵液至50 mL离心管，高速离心20 min，倒掉上清液，称质量，根据前后质量差计算细胞生物量。总蛋白含量参照Bradford蛋白测定试剂盒说明书进行。以亚甲蓝方法测定重组酵母细胞活性，每隔24 h取样进行细胞活性测定。

2　结果与分析

2.1tll和vhb密码子分析及优化

图1　1 tlltll原始基因与优化后的tlltll-optopt基因序列比较Fig.1　Sequence comparison between the original （tll） and the optimized （tll-opt） gene

图2　2 vhbvhb原始基因与优化后的vhbvhb-optopt基因序列比较Fig.2　Sequence comparison between the original （vhb） and the optimized （vhb-opt） gene

根据毕赤酵母密码子偏好性，通过在线软件对tll和vhb基因进行分析，发现在原始tll和vhb基因中存在多个低频密码子，如编码Arg的CGA和CGT、编码Gly的GGC、编码Leu的CTC、编码Ser的AGT以及编码Pro的CCC。这些低频密码子影响tll和vhb在毕赤酵母的表达。根据毕赤酵母密码子的偏好性，通过密码子优化，本实验用高频密码子替换了这些低频密码子，如将编码Arg的CGA和CGT替换为AGA、编码Gly的GGC替换为GGT等。经过优化，tll基因的GC含量由原来55%降低到51%，而vhb基因则由42%提高到51%。碱基A、T、C和G均匀分布于优化后的tll和vhb基因，减少了AT和GC富集区，利于tll和vhb基因在毕赤酵母的表达。通过对优化后的tll-opt和vhb-opt基因进行分析发现：tll基因总共有202 个碱基进行了优化，vhb基因总共有58 个碱基进行了优化。优化后的tll-opt和vhb-opt基因与原始基因的相似性分别为81%和88%（图1和图2）。

2.2密码子优化提高Thermomyces lanuginosus脂肪酶在毕赤酵母的表达

图3　表达载体pPICZαAICZA-tlltll-optopt， pPICZαAICZA-tlltll线性化（A）和表达载体pPICZαAICZA-tlltll-optopt， pPIC3.5KC3.5K-vhbvhb-optopt酶切鉴定（B）BFig.3　Electrophoretogrom of linearized pPICZαA-tll-opt and pPICZαA-tll （A） and restriction enzyme digestion of pPICZαA-tll-opt and pPIC3.5K-vhb-opt （B）

优化后的Thermomyces lanuginosus脂肪酶基因（tllopt）用EcoRI和XbaI进行酶切并和pPICZαA进行连接，得到表达载体pPICZαA-tll-opt（图3B）。分别将表达载体pPICZαA-tll-opt和pPICZαA-tll线性化（图3A），转化至毕赤酵母X33得到含有tll-opt基因和tll基因的重组转化子。通过分析测定，筛选到4 个高酶活转化子，两个含有tll-opt基因（命名为X33/tll-opt-1和X33/tll-opt-2），另外两个含有tll基因（命名为X33/tll-1和X33/tll-2）。为了进一步比较这4 个转化子的酶活力，分别在摇瓶培养条件下测定这4 个转化子的酶活力及总蛋白质含量。摇瓶培养96 h后，X33/tll-1、X33/tll-2、X33/tll-opt-1和X33/tll-opt-2的酶活力分别为6、7、15 U/mL和16 U/mL。总蛋白质含量分别为0.12、0.13、0.21 mg/mL和0.22 mg/mL。通过分析比较，选择重组菌株X33/tll-2和X33/tll-opt-2做下一步实验的出发菌株。

2.3VHb共表达提高Thermomyces lanuginosus脂肪酶在毕赤酵母的表达

将合成的透明颤菌血红蛋白基因（vhb-opt）用EcoRI和NotI进行酶切和pPIC3.5K进行连接，得到表达载体pPIC3.5K-vhb-opt（图3B）。以X33/tll-opt-2为宿主，将表达载体pPIC3.5K-vhb-opt和pPIC3.5K线性化转入X33/tllopt-2。经过筛选得到两株高酶活转化子分别命名为VHb+（X33/tll-opt-2含有vhb-opt基因）和VHb-（X33/tll-opt-2不含有vhb-opt基因）。将空白宿主酵母X33、重组工程菌X33/tll-opt-2以及VHb+和VHb-在摇瓶条件下进行诱导培养。培养96 h后X33、X33/tll-opt-2、VHb-和VHb+的酶活力分别为0、16、16.5 U/mL和23 U/mL；细胞生物量分别为28.5、28、29 g/L和38 g/L。由上述结果可知，VHb共表达可以提高重组工程菌的细胞生物量和脂肪酶酶活力，培养96 h后，VHb+的酶活力和细胞生物量分别是VHb-的1.39 倍和1.31 倍。

2.4重组酵母工程菌的高密度发酵培养

图4　重组工程菌X33/tll-2和X33/tll opt-2 50 L发酵罐发酵培养Fig.4　 Lipase activity and total protein content of X33/tll-2 and X33/tll-opt-2 during batch fermentation in 50 L bioreactor

重组工程菌株X33/tll-2和X33/tll-opt-2在50 L发酵罐的生长及产酶曲线如图4所示。当诱导时间为144 h，重组工程菌X33/tll-2和X33/tll-opt-2的发酵酶活力均达到最大分别为201 U/mL和430 U/mL，相对于原始基因，密码子优化后的tll-opt基因的表达酶活力提高了1.14 倍。当诱导时间为168 h，重组工程菌X33/tll-opt-2总蛋白质量浓度达到最大值为3.8 mg/mL，是重组工程菌X33/tll-2总蛋白质量浓度的1.8 倍。重组工程菌株VHb+和VHb-在50 L发酵罐的生长及细胞生物量如图5所示，VHb+的酶活力和细胞生物量均高于VHb-。当诱导时间为144 h时，VHb+的酶活力和细胞生物量均达到最大值分别为610 U/mL和460 g/L；相同条件下，VHb-的酶活力和细胞生物量分别为431 U/mL和400 g/L。相对于VHb-，VHb+的酶活力和细胞生物量分别提高了42%和15%。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析发现（图6），重组LN的分子质量约为38 kD，与预测的大小相近。用Quantity One软件对蛋白条带进行定量分析发现上清液中重组LN蛋白约占总蛋白含量的80%。

图5　重组工程菌VHb+和VHbVHb- 50 L发酵罐发酵培养Fig.5　Lipase activity and cell weight of VHb+and VHb-during batch fermentation in 50 L bioreactor

图6　SDS-PAGE分析不同重组酵母工程菌在50 L发酵罐培养144 h后的重组蛋白Fig.6　SDS-PAGE analysis of the recombinant lipase from different recombinant strains cultivated in 50 L bioreactor after 144 h cultivation

图7　重组工程菌VHb+和VHbVHb-在50 L发酵罐不同诱导时间下的细胞活性Fig.7　Cell viability profile of VHb+and VHb-during batch fermentation in 50 L bioreactor under different induction time

重组工程菌VHb+和VHb-在不同诱导时间的细胞活性如图7所示。随着诱导时间的延长，VHb+和VHb-的细胞活性逐渐降低，在整个发酵过程中VHb+的细胞活性高于VHb-，当诱导时间为168 h时，VHb+的细胞活性为86%，而VHb-的细胞活性为75%。

3　讨 论

毕赤酵母作为一种成熟的真核表达系统，在表达方面有着许多优点：如易于操作、培养条件简单、便于工业化生产等。密码子优化可以有效地提高异源基因在毕赤酵母的表达水平。研究表明，根据毕赤酵母密码子偏好性对米根霉脂肪酶基因密码子进行优化使其表达酶活力从28.7 U/mL提高到132.7 U/mL［25］。通过优化地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶的密码子，使其在毕赤酵母的表达酶活力提高了2.62 倍［26］。本实验通过优化tll的密码子，提高了其在毕赤酵母X33的表达量。在摇瓶培养条件下，重组工程菌X33/tll-opt-2最高表达酶活力为16 U/mL，是原始基因表达酶活力的2.28 倍。在50 L发酵罐培养条件下，重组工程菌X33/tll-opt-2最高表达酶活力为430 U/mL，是原始基因表达酶活力的2.14 倍。溶氧是毕赤酵母高密度发酵的一个关键因素，溶氧的高低直接影响到异源蛋白在毕赤酵母的表达水平。VHb蛋白可以提高毕赤酵母在高密度发酵条件下的溶氧，从而提高毕赤酵母的细胞活性和能量代谢，最终使重组毕赤酵母高效的表达异源蛋白。在本研究中，将vhb-opt转入X33/tll-opt-2得到重组工程菌VHb+。在50 L发酵罐培养条件下，重组工程菌VHb+的最大酶活力为610 U/mL，分别是优化后基因和原始基因表达酶活力的1.41 倍和3.03 倍。

随着对毕赤酵母研究的深入，会有越来越多的优化方法用来提高异源蛋白在毕赤酵母的表达量。但是每种优化方法都有其本身的局限性，因此根据这些方法的特点，进行两两结合或多种结合能够进一步提高毕赤酵母表达水平。在本研究中将密码子优化和VHb蛋白共表达这两种方法进行结合使重组耐热脂肪酶LN在毕赤酵母的表达酶活力从201 U/mL提高到610 U/mL。本研究结果表明，将密码子优化和VHb蛋白共表达这两种方法进行结合可以有效提高重组蛋白在毕赤酵母的表达量。

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［26］ WANG Jianrong， LI Yangyuan， LIU Danni， et al. Codon optimization significantly improves the expression level of α-amylase gene from Bacillus licheniformis in Pichia pastoris［J］. BioMed Research International， 2015， 2015： 1-9. DOI：10.1155/2015/248680.

Enhanced Production of Thermomyces lanuginosus Lipase in Pichia pastoris by Codon Optimization and Co-expression of Vitreoscilla Hemoglobin

WANG Jianrong， LIU Danni， XIA Yu， YANG Ling， LIU Jinshan， TANG Ye， CHEN Lizhi， HUANG Jiale， LI Yangyuan*
（Guangdong VTR Bio-Tech Co. Ltd.， Zhuhai 519060， China）

The codon usage of Thermomyces lanuginosus lipase （tll） and Vitreoscilla hemoglobin （vhb） gene were optimized by online software according to P. pastoris preferred codon usage. The G + C contents of the codon-optimized genes tll-opt and vhb-opt were increased from 46% to 49% and 42% to 51%， respectively. The nucleotides A， T， C and G dispersed evenly in the optimized genes， thereby eliminating AT- or GC-rich motifs. The tll and tll-opt genes were ligated into pPICZαA and transformed into P. pastoris X33， respectively. The recombinant strains containing tll and tll-opt were cultivated in shaking flask and 50 L bioreactor， respectively. In shake-flask level， the maximum lipase activities of X33/tll and X33/tll-opt were 7 and 16 U/mL， respectively. In 50 L bioreactor， the maximum lipase activities produced by X33/tll and X33/tll-opt were 201 U/mL and 430 U/mL. To further increase the expression of tll-opt， the vhb-opt gene was transformed into the recombinant strain containing tll-opt to form recombinant strain VHb+. In shake-flask level， the maximum lipase activity of VHb+was 23 U/mL， which was 139% and 328% higher than that from the tll-opt gene and the wild-type gene （tll），respectively. The maximum lipase activity of VHb+in 50 L bioreactor was 610 U/mL， which was 141% and 303% higher than that from the tll-opt gene and the wild-type gene （tll）.

codon optimization； lipase； Vitreoscilla hemoglobin； high cell density fermentation

10.7506/spkx1002-6630-201619023

Q81

A

1002-6630（2016）19-0135-06

王建荣， 刘丹妮， 夏雨， 等. 密码子优化及透明颤菌血红蛋白共表达提高耐热脂肪酶在毕赤酵母的表达［J］. 食品科学，2016， 37（19）： 135-140. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619023. http：//www.spkx.net.cn

WANG Jianrong， LIU Danni， XIA Yu， et al. Enhanced production of Thermomyces lanuginosus lipase in Pichia pastoris by codon optimization and co-expression of Vitreoscilla hemoglobin［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 135-140. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619023. http：//www.spkx.net.cn

2015-11-19

国家高技术研究发展计划（863 计划）项目（2014AA093514）

王建荣（1985—），男，工程师，硕士研究生，研究方向为分子生物学与酶工程。E-mail：believe1234@126.com

李阳源（1983—），男，高级工程师，博士研究生，研究方向为分子生物学与酶工程。E-mail：liyangyuanvtr@163.com