抑制口腔变异链球菌的乳酸菌筛选及其抑菌机理

郭夏蕾，张　健，杨贞耐*

（北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，食品质量与安全北京实验室，北京 100048）

抑制口腔变异链球菌的乳酸菌筛选及其抑菌机理

郭夏蕾，张健，杨贞耐*

（北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，食品质量与安全北京实验室，北京 100048）

利用乳酸菌能抑制有害菌的特性，从实验室保藏的乳酸菌中筛选能抑制口腔变异链球菌的菌株，并测定了筛选菌株的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），以及其对变异链球菌菌膜形成和黏附性的影响，初步研究其抑菌机理。结果表明，有5 株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1对变异链球菌具有明显的抑制作用。4 株变异链球菌指示菌中，变异链球菌（Streptococcus mutans）1.2499、1.2500对植物乳杆菌比较敏感。植物乳杆菌K25对变异链球菌的抑制作用比其他4株植物乳杆菌的作用更明显，其MIC最低（1.25×107～2.50×107CFU/mL）。同时，菌株K25对变异链球菌菌膜形成的抑制率较高，还显著地降低变异链球菌的黏附率。对菌株K25抑菌机理的初步研究表明，其代谢过程中产生的乳酸和过氧化氢起到了主要的抑菌作用。

变异链球菌；益生菌；植物乳杆菌；抑菌活性

龋齿是一种常见的口腔疾病，对口腔健康危害很大。其原因是变异链球菌（Streptococcus mutans）与口腔中的碳水化合物共同作用，形成的有机酸（主要是乳酸）不断地侵蚀包裹在牙齿外面的牙釉质，进而使牙齿硬组织发生去矿化作用而形成龋齿［1］。变异链球菌的致病作用依赖于其对光滑牙面的黏附能力，一般来说，这种黏附作用主要通过两个阶段实现［2-4］：首先是变异链球菌通过氢键和疏水作用等蔗糖非依赖性黏附实现初始黏附；然后是经蔗糖依赖性黏附，主要是水不溶性胞外多糖，使变异链球菌黏附到牙面上，该过程在变异链球菌定殖到牙面的过程中发挥主要作用。对于龋齿的治疗通常是使用抗生素药物，但长期使用抗生素不仅会使口腔中微生物系统失衡，还会使细菌耐药性增强，不利于口腔健康［5］。乳酸菌是一种有益于人体健康的重要微生物，同时也存在于人口腔中，对于维持口腔微生态平衡具有重要作用［6］。从乳酸菌中筛选有益于口腔健康的益生菌受到了研究者们越来越多的关注。

随着益生菌疗法在防治胃肠道感染疾病方面的优势日益明显，这种治疗方式也逐渐应用到口腔领域［7-8］。近年来，很多的研究表明，益生菌在保持口腔健康、预防口腔疾病等方面都起到了重要作用［9］。益生菌能够在一定程度上抑制致龋菌的活性，尤其可减少变异链球菌的数量，大大减小了龋病的发生率［10］。此外，口腔中的乳杆菌还能够抑制牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）等导致牙周炎的致病菌和中间普雷沃菌（Prevotella intermedia）的生长［11］。所以，利用益生菌的抑菌特性来抑制口腔中有害菌，减少龋齿等口腔疾病的发生，同时不破坏口腔微生物平衡，是一种很好的预防和治疗方法。

本研究从实验室保藏的乳酸菌菌株中筛选出对口腔变异链球菌具有抑制作用的优良菌株，并研究了乳酸菌对变异链球菌菌膜形成和黏附性的抑制作用，为进一步利用乳酸菌的益生特性来预防与改善龋齿等口腔疾病提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种

乳酸菌共96株，由北京工商大学食品质量与安全北京实验室保藏，其中植物乳杆菌K25由吉林省农业科学院提供。口腔致病菌变异链球菌1.3771、1.2500、1.2499购于中国普通微生物菌种保藏所；变异链球菌10438购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2试剂与培养基

甲醇、冰醋酸、结晶紫、乳酸、乙酸 北京化工厂；胰蛋白酶、胃蛋白酶、过氧化氢酶 美国Sigma公司。

MRS液体培养基：葡萄糖20 g、蛋白胨10.00 g、牛肉膏10.00 g、酵母浸粉5.00 g、无水乙酸钠5.00 g、柠檬酸钠5.00 g、磷酸氢二钠2.00 g、吐温-80 1 mL、七水硫酸镁0.50 g、硫酸锰0.05 g，加水至1 000 mL，1 mol/L乙酸调至pH 6.6。121 ℃、102 kPa条件下灭菌15 min。

BHI液体培养基：心提取物5.0 g、脑提取物12.5 g、蛋白胨10.0 g、葡萄糖2.0 g、NaCl 5.0 g、Na2HPO42.5 g、琼脂15.0 g，蒸馏水定容至1.0 L，pH 7.4。121 ℃、102 kPa条件下灭菌15 min。

1.2仪器与设备

MLS-3750高压蒸汽灭菌器 日本三洋公司；CR21GⅢ立式高速冷冻离心机、U-3900紫外-可见分光光度计 日本日立公司；数显pH 计 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；ELx800酶标仪 美国Bio-Rad仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1抑制变异链球菌生长的乳酸菌筛选

采用牛津杯法筛选出可以抑制变异链球菌的乳酸菌，具体操作参考Bosch等［12］的实验方法。将1.5 g/100 mL的BHI琼脂培养基倒入平板中，待凝固后分别取20 μL变异链球菌10438、1.2499、1.3771、1.2500菌液涂布于平板上，然后将牛津杯固定在平板上，取100 μL提前活化好的乳酸菌的上清液加入到牛津杯中，将平板放在37 ℃恒温培养箱中，培养24 h。测量抑菌圈的直径，最终抑菌圈的大小可以反映菌株对变异链球菌生长抑制作用的强弱［13-14］。抑菌效果按以下标准评定：无抑菌圈，代表无抑制作用（-）；抑菌圈直径0～3 mm，代表抑菌效果弱（+）；抑菌圈直径3～6 mm，代表抑菌效果良好（++）；抑菌圈直径＞6 mm，代表抑菌效果强（+++）［10］。

1.3.2植物乳杆菌对变异链球菌生长过程的影响

将筛选到的植物乳杆菌菌株按体积分数3%接种于MRS液体培养基中，37 ℃培养16 h后10 000r/min离心 15 min得上清液，分别测定不同植物乳杆菌培养上清液对变异链球菌生长的影响。每株变异链球菌按体积分数3%的接种量接种于5 mL BHI液体培养基中，分别添加5 mL植物乳杆菌培养上清液，37 ℃培养48 h，每4 h取出一定量培养液，在600 nm波长处测定其光密度（OD）值。每组设置3 个平行，绘制变异链球菌的生长曲线。以不添加植物乳杆菌上清液的变异链球菌的生长曲线为对照。

1.3.3植物乳杆菌对变异链球菌的最小抑菌浓度的测定

用紫外分光光度计将筛选出的抑菌效果较好的植物乳杆菌菌株的上清液，调整到1.00×108CFU/mL，分别稀释至菌液浓度5.00×107、2.50×107、1.25×107、6.25×106、3.12×106CFU /mL，分别对变异链球菌做抑菌实验，方法见1.3.1节牛津杯法。最小抑菌浓度以有抑菌圈的最小浓度为准。

1.3.4植物乳杆菌对变异链球菌菌膜形成的抑制作用

利用BHI液体培养基将活化好的变异链球菌的菌液浓度调整到1.0×108CFU/mL，将植物乳杆菌K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1活化后， 5 000 r/min离心5 min，用滤膜（0.22 μm）过滤，得到上清液，取100 μL菌液与100 μL上清液混合均匀，加入到96 孔微量板中，以只添加MRS液体培养基的孔为阴性对照。37 ℃培养24 h后，弃掉孔中培养液，加入200 μL PBS，将每孔清洗3 次，清洗时需不断强烈振动以除去未黏附的细菌。弃掉PBS，每孔加入200 μL 95%甲醇，固定15 min，弃掉甲醇后，置于室温下自然干燥。再在每孔加入200 μL 2%的结晶紫，革兰氏染色5 min，用去离子水冲洗，去掉多余的染料，室温条件下自然干燥。每孔再加入160 μL 体积分数33%的冰醋酸，重新将黏附在细菌上的染料溶解下来。从每孔取125 μL可溶性染料转移到新的96 孔板中，在630 nm波长处测定OD值［15］。菌膜抑制率计算见公式（1）。

1.3.5植物乳杆菌对变异链球菌黏附性的影响

参照文献［16］中的方法进行细菌的黏附性实验。将试管与水平面呈30° 角放置并固定，每组设3 个平行管，每个试管分别加3 mL植物乳杆菌上清液和3 mL变异链球菌菌悬液，37 ℃厌氧培养24 h。取出试管，分别收集试管中紧密黏附、松散黏附和非黏附于试管壁的细菌，收集方法参考周智等［17］的方法。以只添加MRS培养基的孔为对照。将收集好的菌悬液分别加入96 孔微量板中，每孔加200 μL，用PBS调零，用酶标仪测定每孔630 nm波长处的吸光度。按公式（2）计算细菌黏附率，其中紧密黏附菌悬液的吸光度记为A紧，非黏附和松散黏附菌悬液的吸光度记为A非+松。

1.3.6植物乳杆菌对变异链球菌抑菌机理的分析

1.3.6.1乳酸对变异链球菌的影响

用乳酸溶液调MRS液体培养基直至与植物乳杆菌K25培养上清液相同的pH值（pH 4.04），釆用牛津杯法分别做植物乳杆菌K25培养上清液和乳酸培养液对变异链球菌1.2499、1.2500的抑菌实验，静置24 h后测量抑菌圈直径。实验组为用乳酸调节的上清液，对照组为植物乳杆菌K25培养物上清液。

1.3.6.2过氧化氢酶对变异链球菌的影响

在植物乳杆菌K25培养上清液中分别加入适量过氧化氢酶，使过氧化氢酶的最终质量浓度为0.5 mg/mL，于28 ℃恒温水浴2 h 后取出，静置24 h后用牛津杯法测定过氧化氢酶对变异链球菌1.2499、1.2500抑菌圈的大小，对照组为不加过氧化氢酶的植物乳杆菌K25培养上清液。

1.3.6.3蛋白酶对变异链球菌的影响

在植物乳杆菌K25的培养上清液中加入一定量胃蛋白酶和胰蛋白酶，使蛋白酶最终质量浓度为1 mg/mL，于28 ℃恒温水浴2 h后取出，静置24 h后牛津杯法测定对变异链球菌1.2499、1.2500的抑菌圈大小，对照组为未经蛋白酶处理的植物乳杆菌K25培养上清液。

1.4数据统计分析

采用SPSS 16.0软件进行数据统计处理，Turkey检验方法用于比较各实验组与对照组之间差异的显著性。P＞0.05表示差异不著性，P＜0.05表示差异显著。

2　结果与分析

2.1对变异链球菌具有抑制作用的乳酸菌的筛选

从实验室保藏的96 株乳酸菌中筛选到对变异链球菌具有一定抑制作用的7 株植物乳杆菌。由表1可知，不同的植物乳杆菌对4 株变异链球菌的抑菌活性不同，其中菌株K25对4 株变异链球菌都有明显的抑菌活性，且对变异链球菌1.2499、1.3771、10438 这3 株变异链球菌的抑菌圈都达到了13.00 mm以上，抑菌圈最大可达16.30 mm，因此表明植物乳杆菌K25对变异链球菌的抑菌效果比较好。另外4 株植物乳杆菌SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1也具有较明显的抑菌效果，抑菌圈最大也可达到12.50 mm。植物乳杆菌QH25-1和QH35-3-2对变异链球菌抑制作用相对较弱。

表1　7 株植物乳杆菌对变异链球菌的抑菌效果Table1　Inhibitory effect of seven L. plantarum strains on Streptococcus mutans

2.2植物乳杆菌对变异链球菌生长的影响

植物乳杆菌K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1对变异链球菌1.2499、1.2500、1.3771、10438生长过程的影响如图1所示。在变异链球菌培养过程中添加上述植物乳杆菌培养上清液，可使4 株变异链球菌的生长受到不同程度的抑制，其培养基OD值均低于对照组的OD值。由图1还可知，添加上述植物乳杆菌培养上清液，可不同程度地延缓变异链球菌进入对数生长期，从而使变异链球菌的增殖速率减慢；不同的植物乳杆菌菌株对同一株变异链球菌生长的影响不同，同一株植物乳杆菌对不同的变异链球菌菌株生长的影响也不同。同时，添加植物乳杆菌K25培养上清液，使4 株变异链球菌的生长曲线均处于最低水平，说明植物乳杆菌K25对变异链球菌的抑制活性最强，与上述基于牛津杯固体培养基抑菌实验的结果一致。

图1　植物乳杆菌K25、SKT109、YW3-2、YW5-1、YW1-1对变异链球菌1.2499（A）、1.2500（B）、1.3771（C）、10438（D）生长的影响Fig.1　Effect of Lactobacillus plantarum K25， SKT109， YW3-2，YW5-1， YW1-1 on the growth of Streptococcus mutans 1.2499 （A），1.2500 （B）， 1.3771 （C） and 10438 （D）

2.3植物乳杆菌对变异链球菌的最小抑菌浓度

植物乳杆菌对变异链球菌的最小抑菌浓度可以在某种程度上反映变异链球菌对植物乳杆菌的敏感性，同时也反映植物乳杆菌对变异链球菌的抑菌效果；抑菌浓度越低，说明变异链球菌对植物乳杆菌越敏感，植物乳杆菌的抑菌作用越强［18-19］。由图2可知，植物乳杆菌K25对变异链球菌1.2499的最小抑菌浓度为1.25×107CFU/mL，对1.3771、1.2500和10438菌株的最小抑菌浓度为2.5×107CFU/mL。而植物乳杆菌SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1对4 株变异链球菌的最小抑菌浓度相对较高，在5.0×107～1.0×108CFU/mL之间。5 株植物乳杆菌对变异链球菌1.2499和1.2500的最小抑菌浓度为1.25×107CFU/mL和2.5×107CFU/mL，低于对其他2 株变异链球菌的最小抑菌浓度，表明此2 株变异链球菌对本实验的植物乳杆菌的抑制作用更敏感。

图2　植物乳杆菌对变异链球菌的最小抑菌浓度Fig.2　Minimum inhibitory concentration of Lactobacillus plantarum against Streptococcus mutans

2.4植物乳杆菌对变异链球菌菌膜形成的抑制作用

图3　植物乳杆菌对变异链球菌菌膜形成的影响Fig.3　Effect of Lactobacillus plantarum on the biofilm formation of Streptococcus mutans

由图3可知，5 株植物乳杆菌对4 株变异链球菌的菌膜形成具有不同程度的抑制作用，但都对变异链球菌1.2499具有最高的抑制率，达到60%以上，其次是变异链球菌1.2500，抑制率略高于40%，说明这2 株变异链球菌对植物乳杆菌比较敏感。对于变异链球菌1.3771和10438，植物乳杆菌K25对变异链球菌1.3771的抑制活性较明显（抑制率为51.1%），而其他4 株植物乳杆菌对菌株1.3771和10438菌膜形成的抑制率较低。此外，植物乳杆菌K25对变异链球菌1.2500和10438的菌膜形成抑制率也略高于其他4 株菌。菌膜的形成能提高致病菌对抗生素的抗性，继而可能诱导感染疾病［15］。因此，本研究筛选的5 株植物乳杆菌对于通过抑制变异链球菌的菌膜形成，降低口腔龋齿病的发生几率具有潜在的应用价值。

2.5植物乳杆菌对变异链球菌黏附性的影响

5 株植物乳杆菌对4 株变异链球菌在光滑面上的黏附性的影响如图4所示，对于同一株变异链球菌，加入不同的植物乳杆菌培养上清液之后，其黏附率不同。而同一株植物乳杆菌对不同的变异链球菌的黏附率的影响也不同。但对于4株变异链球菌在添加了所有的植物乳杆菌培养上清液之后都比未添加时的黏附率低，说明5 株植物乳杆菌都降低了4 株变异链球菌的在光滑面上的黏附率。对于变异链球菌1.2499，对照组的黏附率为47.46%，在添加植物乳杆菌K25培养上清液后，其黏附率下降为24.6%，比其他4 株植物乳杆菌对其抑制率要低，说明菌株K25对变异链球菌1.2499黏附的抑制效果最好。同样，对于其他3 株变异链球菌，在添加了菌株K25之后，其黏附率也低于其他4 株植物乳杆菌的黏附率，分别为15.64%、8.36%和7.02%，所以，植物乳杆菌K25对4 株变异链球菌黏附的抑制作用都强于其他4 株植物乳杆菌。据报道，口腔变异链球菌必须首先附着于人体牙齿表面，才能造成对人体牙齿的危害，导致龋病的发生［20］。因此，本实验筛选获得的植物乳杆菌，尤其是菌株K25，对于降低变异链球菌在牙齿表明的黏附，防止龋病具有潜在的应用价值。

图4　植物乳杆菌对变异链球菌黏附性的影响Fig.4　Effect of L. plantarum on the adhesion ability of Streptococcus mutans

2.6植物乳杆菌对变异链球菌抑菌机理的分析

以对变异链球菌具有明显抑制活性的植物乳杆菌K25为例，对其作用机理进行分析。

2.6.1乳酸对变异链球菌的影响

由表2可知，菌株K25培养上清液对变异链球菌1.2499和1.2500的抑制作用略高于对照组样品，但二者差异不显著（P＞0.05）。因此，植物乳杆菌K25的抑菌作用与其产生的乳酸有关，同时还存在其他的抑菌因素。

表2　植物乳杆菌K25培养上清液（或培养基）的不同处理方式对变异链球菌的抑制作用Table2　Effect of different treatments for medium and culture　supernatant of L. plantarum on its inhibition against Streptococcus mutans

2.6.2过氧化氢酶对变异链球菌的影响

比较添加和不添加（对照组）过氧化氢酶的植物乳杆菌K25培养上清液对变异链球菌1.2499和1.2500的抑制作用（表2）可知，对照组的抑菌圈直径分别为（15.50±0.93）mm和（14.76±1.06）mm，而实验组的抑菌圈直径分别为（12.65±0.78）mm和（12.15±0.83）mm，对照组与实验组的抑菌圈大小有显著性差异（P＜0.05）。因此可以推测，过氧化氢对菌株K25的抑菌作用起到了重要的贡献。

2.6.3蛋白酶对变异链球菌的影响

比较添加和不添加（对照组）蛋白酶的植物乳杆菌K25培养上清液对2株变异链球菌的抑菌作用（表2）。结果表明，对照组与实验组抑菌圈直径无显著差异（P＞0.05）。可以推测，菌株K25没有产生对变异链球菌具有明显抑制作用的蛋白质类细菌素。

3　讨 论

近年来，有关益生菌对人体健康的有益作用及在疾病预防方面的研究应用越来越多［21］。有研究者发现，人体口腔中的益生菌可以抑制口腔致病菌的黏附和定殖，对于保持口腔微生态的平衡及龋齿等口腔疾病的预防具有重要作用［22-24］。目前报道的益生菌主要包括乳杆菌和双歧杆菌两大类［9］。本研究筛选到7 株对变异链球菌的生长、黏附和菌膜形成具有明显抑制作用的植物乳杆菌，尤其是菌株K25曾被报道具有良好的益生特性［25］，其在口腔疾病预防方面具有潜在的应用价值。

变异链球菌具有较强的耐酸能力，通常乳酸菌对变异链球菌的抑制作用弱于对其他常见口腔致病菌的抑制，表现为前者具有更小的抑菌圈［11，26］。由于变异链球菌具有较强的菌体聚集能力，因此，在采用牛津杯法进行抑菌实验时，应将变异链球菌均匀涂布于固体培养基上，以便获得边缘清晰的抑菌圈。据报道，乳酸菌对变异链球菌的抑制作用与其在生长繁殖过程中产生的各种初级和次级代谢产物，如乳酸、过氧化氢和一些细菌素等密切相关［27］。本研究的抑菌实验表明，植物乳杆菌K25的抑菌作用主要归因于其代谢过程中产生的乳酸和过氧化氢。

变异链球菌作为龋齿的主要病原细菌，它能使糖转变为复杂的多糖类，产生黏稠性多糖物质附着于牙齿表面从而形成牙斑，并有利于变异链球菌黏附定殖到牙面上发挥其致病作用［28］。本研究的黏附实验结果说明，植物乳杆菌能有效地降低变异链球菌1.2499、1.2500等致病菌的黏附率，可以阻断变异链球菌黏附到牙齿表面的过程，进而减少牙斑的生成。

变异链球菌黏附于口腔牙面之后会产生菌膜，生成的菌膜又进一步促进其在牙面上的黏附，菌膜还起到保护菌体不被酸、碱、抗生素等杀死的作用。本研究的菌膜抑制实验结果表明，植物乳杆菌K25、SKT109、YW3-2、YW5-1和YW1-1都可以抑制变异链球菌菌膜的形成，从而减少变异链球菌在牙齿上的定殖黏附，使变异链球菌更容易被口腔或者人体中的抑菌和杀菌物质抑制或直接将其杀死，减少龋病的发生，保护口腔健康。

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Screening of Lactic Acid Bacteria for Inhibiting Oral Streptococcus mutans and Preliminary Study of Antibacterial Mechanism

GUO Xialei， ZHANG Jian， YANG Zhennai*
（Beijing Laboratory of Food Quality and Safety， Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Technology and Business University， Beijing 100048， China）

Considering that lactic acid bacteria （LAB） that can inhibit harmful bacteria， LAB strains stored in our laboratory were screened for inhibiting oral Streptococcus mutans. The screened strains were measured for minimum inhibitory concentration （MIC） and inhibitory effect on biofilm formation adhesion properties of S. mutans， and the underlying mechanism was preliminarily studied as well. The results showed that 5 Lactobacillus plantarum strains including K25，SKT109， YW3-2， YW5-1 and YW1-1 exhibited clear inhibition against S. mutans. Among 4 indicator S. mutans strains，1.2499 and 1.2500 were more sensitive to L. plantarum. L. plantarum K25 showed stronger inhibition than 4 other strains against S. mutans. The MIC value （1.25 × 107-2.50 × 107CFU/mL） of strain K25 was the lowest， the inhibition rate on biofi lm formation of S. mutans was signifi cantly higher， and the inhibitory effect on the adhesion ability of S. mutans was clear. Preliminary studies on the antibacterial mechanism of L. plantarum K25 indicated that lactic acid and hydrogen peroxide produced by the strain played major roles in this activity.

Streptococcus mutans； probiotic； Lactobacillus plantarum； inhibitory activity

10.7506/spkx1002-6630-201619020

TS201.3

A

1002-6630（2016）19-0117-06

郭夏蕾， 张健， 杨贞耐. 抑制口腔变异链球菌的乳酸菌筛选及其抑菌机理［J］. 食品科学， 2016， 37（19）： 117-122. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619020. http：//www.spkx.net.cn

GUO Xialei， ZHANG Jian， YANG Zhennai. Screening of lactic acid bacteria for inhibiting oral Streptococcus mutans and preliminary study of antibacterial mechanism［J］. Food Science， 2016， 37（19）： 117-122. （in Chinese with English abstract）

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201619020. http：//www.spkx.net.cn

2015-12-15

国家自然科学基金面上项目（31571857）

郭夏蕾（1991—），女，硕士研究生，研究方向为乳品生物技术。E-mail：610850207@qq.com

杨贞耐（1965—），男，教授，博士，研究方向为乳品科学及加工技术。E-mail：yangzhennai@th.btbu.edu.cn